耐甲氧西林金黄色葡萄球菌亚单位融合疫苗HI的免疫保护评价及其作用机制研究

发布时间：2017-11-03 16:32

  本文关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌亚单位融合疫苗HI的免疫保护评价及其作用机制研究

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【摘要】：目的： 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种可寄生于宿主体表的条件致病菌，同时也是引起局部化脓性感染，肺炎，心内膜炎及全身脓毒血症等医院获得性感染的主要致病菌。由于抗生素的滥用，出现耐受多种抗生素的新菌株，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的迅速蔓延，使得单纯依靠抗生素治疗该病原菌引起的相关感染变得越来越困难。金黄色葡萄球菌疫苗的研究再次成为全球的热点。 最近几年，发展基于多价保护性的亚单位融合疫苗是新型疫苗设计与研发的优选研究策略。其最主要的目标是利用多价抗原靶向多个毒力因子，而这些毒力因子对病原菌的致病作用十分关键，因而多价抗原的策略更易研发出针对金黄色葡萄球菌的有效疫苗。 在宿主对抗金黄色葡萄球菌感染的过程中，体液免疫与细胞免疫都发挥着重要的作用。理想的抗金黄色葡萄球菌疫苗应该包含一些分泌性毒素抗原和细胞壁偶联的相关抗原，而这些抗原能够激发宿主产生保护性抗体以及诱导产生分泌IFN-γ和(或)IL-17的T细胞，而IL-17对于中性粒细胞驱动与活化十分重要。 本研究的目的是构建基于IsdB与Hla为基础的双价融合疫苗，同时比较该双价疫苗与单价的重组候选抗原在小鼠全身系统性MRSA感染动物模型中的免疫保护作用差异。进一步探究该基因工程双价亚单位融合疫苗所产生的保护性抗体(调理抗体，中和抗体)及获得性免疫细胞应答(IFN-γ，IL-17A)在免疫保护中的作用机制，为新型有效的基因工程多价亚单位融合疫苗的分子设计，抗原选择及配伍优化奠定坚实的实验基础与理论指导。 方法： 1.从MRSA252中提取细菌基因组作为PCR的模板，通过重叠延伸PCR扩增目的基因HI，同时引入酶切位点BamHI与NotI。目的基因双酶切后的回收产物与pGEX-6P-2表达载体相连，转化到Escherichia coli BL21菌株，在IPTG的诱导下表达GST融合蛋白，带GST标签的融合蛋白经PSP酶切初纯，然后经CaptoTMMMC层析，，过Q HP去内毒素精细纯化，最终的产物经SDS-PAGE电泳进行分析。 2.通过尾静脉注射MRSA252细菌，建立BALB/c小鼠全身感染的脓毒症动物模型。BALB/c小鼠用重组蛋白加铝佐剂免疫，并用PBS加铝佐剂作为对照组。小鼠在末次免疫后，用MRSA252致死剂量1×10~9CFU感染小鼠，在感染后的14天里监测小鼠的生存状况。同时，用2.5×10~8CFU感染剂量感染小鼠，并对感染后脏器的细菌定植量与病理损伤进行检测与分析。 3.为了评价重组蛋白疫苗主动免疫后的体液免疫应答，用ELISA的方法检测了针对不同重组蛋白抗原的特异性抗体，同时进行了抗体介导的调理吞噬作用实验。为了评价重组蛋白疫苗的细胞免疫应答，检测了免疫后脾细胞在重组蛋白体外刺激后的分泌的细胞因子水平(IFN-γ，IL-5，IL-17A)，并进行了分泌细胞因子介导的杀伤作用实验。为了评价免疫小鼠感染后肾脏细胞因子的水平，检测了IFN-γ, IL-17A和CXCL2的水平。 结果: 1.构建表达载体质粒pGEX-6P-2-HI，经IPTG诱导，重组蛋白以可溶形式进行表达并且其纯化是高效的，SDS-PAGE分析其蛋白分子量与预期的一致。 2.建立了稳定的BALB/c小鼠全身感染的脓毒症动物模型。重组亚单位融合疫苗HI免疫后，用致死剂量攻毒，与对照组相比，其显著提高了生存保护率(P=0.0002)，与IH, IsdB, Hla,和铝佐剂组,分别提高了6.7%,20%,26.7%和66.7%的保护率；用感染剂量攻毒，与对照组相比，重组蛋白(HI，IH, IsdB，Hla)免疫后均能在一定程度上减少细菌在血液，脾脏，肾脏中的定植，同时减轻了病理的炎性损伤，而在所有组中，HI组的细菌定植量是最低的，同时肾脏的病理损伤也是最轻的。 3.重组亚单位融合疫苗HI免疫后产生了强的抗体应答，其中最高抗体效价为1:512000。产生的抗体针对其对应的亚单位IsdB与HlaH35L也有强的抗原抗体反应。重组抗原HI免疫小鼠后，体外刺激产生了脾细胞产生了较高IFN-γ, IL-5和IL-17A细胞因子水平。HI诱导的免疫反应能够增强体外抗体介导的调理吞噬作用与细胞因子介导的杀伤作用。HI免疫小鼠，在感染后肾脏中IFN-γ, IL-17A和CXCL2水平高于对照组，也高于IsdB和Hla组。 结论： 1.一种基于IsdB与Hla的亚单位融合疫苗HI成功的构建，表达。用该融合的双价疫苗免疫后诱导机体产生了强的抗体与T细胞免疫应答。 2.该双价亚单位融合疫苗产生的免疫保护强于其对应的亚单位产生的免疫保护，该融合双价疫苗HI有可能成为对抗MRSA感染的新型疫苗。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

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本文编号：1137013