铜绿假单胞菌中rsmA正调节基因的筛选及研究

发布时间：2017-11-03 19:24

  本文关键词：铜绿假单胞菌中rsmA正调节基因的筛选及研究

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【摘要】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugionsa)是一种机会致病的革兰氏阴性杆菌,在自然界分布广泛,可导致免疫力下降的患者的发病率和死亡率升高,囊性纤维化患者和烧伤患者也极易感染此菌。该菌也是导致医院感染的三大病原菌之一,且具有广泛的耐药性。 在铜绿假单胞菌中RsmA是一种转录后调节蛋白,它主要是与两个小的调节RNAs即RsmY和RsmZ一起进行作用,进而调节一些毒性相关基因的表达,包括N-酰基高丝氨酸内酯合成基因lasl和rhll,以及氰化氢和鼠李糖脂生物合成的操纵子。在铜绿假单胞菌与呼吸道上皮细胞相互作用时,RsmA通过正调节毒力相关的III型分泌系统来促进肌动蛋白解聚、增强细胞毒性及提高细菌的抗吞噬作用。RsmA的缺失改变了一些涉及重要毒性的各途径及体系的相关基因的表达,包括铁的摄取,铜绿假单胞菌喹诺酮信号的合成,化合物外排泵的形成以及运动性。急性感染和慢性感染也与RsmA调节的一系列基因的表达有密切联系。虽然之前有关RsmA对下游基因的表达调控研究取得了很大的进展,但是RsmA本身的调控网络并未完全清楚,很有必要在基因组水平,对rsmA具有调节作用的基因进行筛选和研究。 本课题以rsmA基因表达为线索,构建染色体组上整合有rsmA-luxCDABE报道子的铜绿假单胞菌菌株,在此基础上构建了随机转座突变体库,并可通过rsmA-luxCDABE报道子发光强度的变化来筛选对rsmA基因表达有影响的转座突变体。经过筛选共得到14株正调节rsmA表达的突变体,通过随机PCR及测序比对,确定转座子的插入位点,最终确定rsmA调节基因。对这些转座突变体进行表型测定的结果表明,细菌运动性、绿脓菌素、胞外多糖产量等均受到不同程度的调节。 研究发现,转座突变体F5的各个表型都发生了明显变化,突变体F5被破坏的基因为hemK(PA4664),该基因编码甲基转移酶。对突变体F5进行互补实验,结果表明其表型可恢复至野生型水平。为了进一步研究该基因的功能及与rsmA的相互作用,构建了hemK的敲除突变体PAO(AhemK)。结果表明,与野生型PAO1相比,突变体PAO(△hemK)的运动能力显著降低,胞外多糖产量明显增多,表明HemK可以正调节细菌运动性,负调节胞外多糖产量。突变体[AO(△hemK)的胞外蛋白酶及鼠李糖脂的合成能力没有明显变化。基因hemK的缺失导致绿脓菌素的合成丧失,且hemK基因正调节phzAl和phzA2。双组份系统相关基因rsmY、rsmZ及gacA在PAO(△hemK)中的表达无明显变化。HemK可正调节III型分泌系统相关基因exoS、exoY、exsC及exsD。这些结果对了解铜绿假单胞菌的致病性及其毒性因子的调节机理提供了线索。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378

【参考文献】

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1 崔钦娜;李芳;邢伟越;迟晓艳;冯志彬;王艳华;葛宜和;刘林德;;铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA的缺失影响2个吩嗪基因簇的表达[J];微生物学报;2012年11期

2 余华;光丽霞;何晓梅;盛哈蕾;张克斌;;铜绿假单胞菌集群运动的研究进展[J];中华医院感染学杂志;2010年20期

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本文编号：1137588