病毒及质粒DNA刺激后小鼠肌细胞内IFN-β与PD-L1的表达情况

发布时间：2017-11-04 15:13

  本文关键词：病毒及质粒DNA刺激后小鼠肌细胞内IFN-β与PD-L1的表达情况

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【摘要】：目的：疫苗接种用于传染性疾病的防控已取得了很大的成绩。经典的疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、类毒素和亚单位疫苗。这些疫苗的成功开发使得许多传染病得到了有效的控制、预防及治疗。但传统疫苗有缺陷，例如死疫苗灭活不全和活疫苗毒力恢复等缺点，所以人们更希望能够研制出安全、廉价、含有多种具有保护作用的免疫原，基因疫苗的应运而生为这种疫苗的开发提供了可能性。 基因疫苗具有多方面的优点，比如既可以诱导体液免疫应答又可以诱导细胞免疫应答；没有死疫苗灭活不全和活疫苗毒力恢复的风险；可编码多种抗原，从而构成多价疫苗；没有亚单位疫苗因蛋白纯化不够诱发异源性免疫应答的风险并且具有设计简单、制备容易、花费较低、相对稳定等等优点，同时还有研究表明，基因疫苗不仅可以预防某些传染病，还可以作为一些治疗性疫苗来治疗一些复杂难治的疾病，例如病毒性肝炎等。这些优点充分的显示出基因疫苗巨大的潜力和应用价值。但是自从90年代基因疫苗诞生以来至今尚无临床可用的DNA疫苗可用于疾病的防治，究其原因是DNA疫苗存在免疫保护作用不强的缺点。 为克服DNA疫苗免疫保护差的弱点，我室和国内外众多研究者采用了多种措施。例如采用不同的接种方式以提高宿主细胞的转染率；采用调节转录调节元件以优化质粒的方法提高抗原的表达；通过在DNA疫苗接种的同时接种含有编码树突状细胞特异性生长因子FLT3l、GM-CSF等的质粒的方法以求增加局部的抗原提高细胞聚集以提高抗原提呈作用；为了提高其免疫保护作用，而采用了使用不同的载体的方法。但均未达到预期效果。 肌肉注射是DNA疫苗的常用接种方式，但对有关肌细胞在DNA疫苗接种后所诱导的免疫应答过程中作用的清楚了解，有可能为DNA疫苗免疫效果的提高找出新的解决途径。肌细胞在不同的生理和病理状态下可表达多种细胞因子，趋化因子和免疫粘附分子等与免疫应答相关的分子，其中干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是可由多种体细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。而PD-L1具有负性调节作用，可能在质粒DNA疫苗作用中使其保护不强起不到免疫的作用。 基于上述考量，本研究以小鼠NOR-10细胞为研究对象，用质粒以及病毒刺激细胞，以观察小鼠肌细胞内IFN-β及PD-L1的变化情况，以探讨其在基因疫苗免疫中的作用及意义。 方法：⑴体外刺激细胞：NOR-10细胞以2×105的密度铺入到6孔板中，24小时后，用LipofectamineTM2000转染PCDNA3.0/VP1以及用重组腺病毒（AD/VP1本科室构建）感染细胞，，未处理细胞加新鲜培养基作为正常对照组。⑵Trizol提取细胞总RNA：细胞经不同处理细胞后，分别在3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时后提取细胞总RNA，未处理组作为正常细胞对照组，进行Real Time PCR。（3）上述转染后以及病毒感染后分别收取3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时的上清培养基做IFN-β的ELISA实验。 结果：（1）用PCDNA3.0/VP1刺激后, Real Time PCR的结果显示PD-L1的mRNA表达在3小时的时候达到高峰，6小时、12小时、24小时、48小时开始缓慢下降，72小时又达到一个高峰；IFN-β的mRNA表达在3小时、6小时持续性升高，在12小时达到高峰，24小时、48小时下降，72小时又达到一个高峰；ELISA实验结果显示，IFN-β的蛋白表达在6小时开始升高,12小时、24小时达到高峰，48小时开始下降，72小时接近正常水平。（2）用腺病毒感染细胞后，Real Time PCR的结果显示PD-L1的mRNA表达在3小时、6小时、12小时持续性升高，在24小时达到高峰,48小时略有下降，72小时达到最高峰；IFN-β的mRNA表达在3小时、6小时、12小时呈现表达抑制，24小时表达较正常细胞略微升高，72小时达到最高；ELISA实验结果显示，IFN-β的蛋白表达在3小时、6小时、12小时接近正常细胞水平，24小时开始升高，72小时达到最高峰。 结论:(1)质粒DNA转染进小鼠肌细胞内后使得小鼠肌细胞内的PD-L1及IFN-β mRNA表达出现波动性的变化；IFN-β蛋白水平的表达出现了与mRNA相关的波动性变化。（2）病毒感染小鼠肌细胞后使得小鼠肌细胞内的PD-L1及IFN-β mRNA的表达出现波动性的变化；IFN-β蛋白水平的表达出现了与mRNA相关的波动性变化。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【共引文献】

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1 唐力;多普勒超声检测胎羊炎症反应综合征的实验研究及机制探讨[D];福建医科大学;2009年

本文编号：1139942