大鼠骨髓源性肝干细胞向肝细胞分化过程中H3K27me2的变化

发布时间：2017-11-06 01:31

本文关键词：大鼠骨髓源性肝干细胞向肝细胞分化过程中H3K27me2的变化

【摘要】：骨髓源性肝干细胞(bone marrow-derived liver stem cell, BMDLSC),指骨髓中拥有肝细胞分化潜能的间充质干细胞,属于非胚胎来源的成体干细胞。BMDLSC是肝细胞在肝外的重要来源,拥有自我更新及分化的多潜能性,可以在特定条件下定向分化为肝细胞。胚胎干细胞是全能细胞,也具有分化为肝细胞的能力。相比胚胎干细胞,BMDLSC拥有取材方便、分离较简单,易于体外培养、研究成本低、不存在胚胎伦理学问题等优点,因而备受关注。肝干细胞因自我更新及分化的潜能,在应用于肝细胞再生及肝组织工程方面被寄予厚望,成为了全世界研究的热点之一。目前大鼠骨髓干细胞体外诱导分化为肝细胞的研究并不少见,但其具体分化调控机制仍不明确。研究表明,表观遗传学在调控干细胞的自我更新及分化中起重要作用,与分化、组织再生、衰老、DNA的损伤与修复、肿瘤发生均起着不可忽视的作用。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰及染色体重塑等内容,其中组蛋白修饰则包括组蛋白甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、ADP核糖基化,这些修饰以及其组合在时间和空间上和生物功能之间的关系,可以作为一种重要的表观遗传标记或语言,因此被称为“组蛋白密码”。其中组蛋白H3修饰变化对细胞的分化、发育的调节尤为突出。在胚胎干细胞的研究中发现,分化过程会诱导产生组蛋白修饰酶,这些酶在动态调节过程中起到了明显抑制作用。通过H3K27去甲基化酶的作用,可以减少靶基因启动子区的H3K27me2甲基化水平,从而解除对基因的抑制,增强基因的表达。有人在对人胚胎干细胞分化的研究中发现,H3K27甲基化及H3K4甲基化能够共同影响转录因子,在人胚胎干细胞早期分化过程中其甲基化修饰变化会通过抑制或激活基因的表达,从而影响分化的进行。还有其它相关研究也证实了H3K27的甲基化与转录起始位点联系紧密。Ferrari等人报道H3K27me2存在于大约70%的总组蛋白H3和染色质分布区域,并通过抑制作用防止细胞的非特异性表达的增强。Pasini等人通过去除PcG蛋白能够显著减少胚胎干细胞中H3K27me2的表达,并最终引起许多发育调节基因的上调。目前骨髓干细胞的组蛋白修饰变化研究较少,BMDLSC体外诱导分化为肝细胞的过程中,组蛋白H3K27me2是否也存在着变化,是否也起着调节作用,目前尚未见报道。本研究将利用免疫磁珠分选法从大鼠骨髓干细胞中分离纯化大鼠BMDLSC,而后通过成熟的诱导方案,在体外诱导BMDLSC定向分化为肝细胞,分别检测不同诱导时间的细胞ALB、AFP的mRNA水平,并以Western blot动态观察分化过程中不同时间点的H3K27me2的表达水平,以验证体外诱导分化肝细胞可行性,并阐明BMDLSC在体外诱导分化为肝细胞的过程中组蛋白H3K27me2的变化,为进一步了解BMDLSC分化过程中组蛋白修饰的调控机制提供理论依据。 1.材料和方法 1.1实验动物雄性Vista大鼠,30只,周龄5-6周,体重90-100g,购于南方医科大学实验动物中心,清结级,生长于SPF级条件下。 1.2主要试剂 One-Step RT-PCR半定量检测试剂盒(大连TaKaRa), Thy-1标记小鼠抗大鼠抗体(美国biolegend), lineage cell depletion kit(德国Miltenyi Biotec),肝细胞生长因子(美国PeproTech EC),10%胎牛血清、DMEM培养基(干粉)(美国Invitrogen),FITC标记山羊抗兔抗体(北京博奥森生物技术有限公司),Ant i-Hi stone H3(dimethyl K27,英国Abcam) 1.3实验方法 1.3.1大鼠骨髓单核细胞的分离与提取乙醚麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠,无菌取胫骨和股骨,剪开两端骨骺,培养液DMEM/MCDB201反复冲洗骨髓腔,冲出骨髓细胞,红细胞裂解液裂解红细胞,过30u m滤网成单细胞悬液。配制密度为1.077kg/L的Percoll液,室温下以2200r/min离心30min；吸取Percoll分离液表面的白膜层,以DMEM培养液洗涤2次,诱导液重悬。台盼蓝染色计算细胞活力,细胞活力95%才被使用。收集中间的白膜层细胞即大鼠骨髓单个核细胞。 1.3.2骨髓干细胞的免疫磁珠分选及流式细胞术检测先用lineage cell depletion kit作阴性分选,获得Lin(-)细胞。取上一步骤所得的单个核细胞在室温下1500r/min离心10mmin,弃去上清液,用PBS进行细胞重悬,按lineage cell depletion kit说明书以10μl/07加入生物素抗体,单克隆抗原簇CD5.CD45R(B220).CDllb.Gr-1(Ly-6G/C).7-4.Ter119,充分混匀后冰上孵育30mmin,按30μl/07加入PBS,再加入生物素抗体磁珠,充分混匀后,冰上孵育30min。加入PBS洗涤2次,室温下1500r/min离心10min,弃去上清,PBS重悬细胞。先用PBS缓冲液冲洗选择柱1次,后将细胞悬液加至阴性选择柱上,于磁场中流过；阳性细胞保留于柱内,阴性细胞收集于离心管中,再用PBS冲洗选择柱3次,筛选所得阴性细胞即Lin(-)细胞。所得Lin(-)细胞悬液室温下1500r/min离心10min,弃去上清液,用PBS进行细胞重悬,按照10μl/07加入Thy-1抗体磁珠,充分混匀后,冰上孵育30min,冰上孵育30min。加入PBS洗涤2次,室温下1500r/mmin离心10min,弃去上清,PBS重悬细胞。先用PBS缓冲液冲洗选择柱1次,后将细胞悬液加至阴性选择柱上,于磁场中流过；阳性细胞保留于柱内,再用PBS冲洗选择柱3次。将选择柱子脱离磁场后,加1ml PBS缓冲液,柱塞推出选择柱中的阳性筛选细胞,即目标细胞Thy-1(+)Lin(-)BMDLSC.以胰蛋白酶消化免疫磁珠分选后的细胞,细胞计数后密度调整为1.0X106个/ml,取细胞悬液,离心后去上清,加入PBS缓冲液,以稀释比为1：100分别加入荧光标记的Thy-1抗体及CD45抗体各10μl,混匀充分后4℃下避光孵育30min,移至流式管,上机检测。 1.3.3BMDLSC的定向诱导与培养将免疫磁珠分选得到Thy-1(+) Lin (-) BMDLSC以1×105细胞/ml接种于铺有25ng/ml的纤连蛋白的6孔板中培养(内置盖玻片)。培养液为高糖DMEM/F12,10%胎牛血清,20mM Hepes (Sigma公司),10-7mol/L地塞米松,青霉素与链霉素。细胞贴壁后更换培养液为高糖DMEM/F122.5%,25ng/ml肝细胞生长因子,20mmol/L Hepes,1Onmol/L地塞米松,青霉素与链霉素进行诱导分化,每3d换液1次。观察细胞生长分化形态。连续诱导14d,分别在0d、7d、14d记录细胞的典型形态并留够充足的样本。取分离后未进行免疫磁珠纯化的骨髓间充质干细胞为阴性对照组。0d组、7d组、14d组、阴性对照组,每组样本重复例数为5。 1.3.4RT-PCR检测肝细胞特异性标记物白蛋白(albumin, ALB)、甲胎蛋白(Alpha-Fetal Protein, AFP) mRNA 取Od、7d、14d细胞总RNA,按照说明书步骤逆转录取得cDNA, RT-PCR检测ALB、AFP的表达(按照试剂盒的说明所标记的方法进行)。ALB引物：上游5'atcctgaaccgtctgtgtgt3',下游5'cagttatccttgtcggcagc3'。AFP引物：上游5’gcgcatccatttccttcctt3',下游5'Tctaaacacccatcgccagt3'。实验以β-actin为内参照,PCR产物取5μL反应产物进行,3%琼脂糖凝胶电泳分析产物片段,比较各期ALB、AFP mRNA的表达量变化。 1.3.5Western blot检测H3K27me2表达情况分别收集分化0,7,14天的细胞,用细胞裂解液RIPA提取蛋白,并加入适量蛋白上样缓冲液后沸水浴加热3-5min,以充分变性样品蛋白,取20μL蛋白,经10%SDS-PAGE分离后转膜。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭膜1h,用一抗Anti-Histone H3(trimethyl K27)(1:200)4℃冰箱孵育过夜后,用TBST洗膜3次(10min/每次),然后配合二抗羊抗兔抗体(1：1000),室温孵育1h后,洗膜3次(10min/每次),最后经ECL试剂显色成像。 1.3.6免疫荧光检测H3K27me2表达情况取分化0、7、14d的骨髓干细胞,固定及通透化处理后清洗,含5%脱脂奶粉的TBST封闭1h；加入H3K27组蛋白甲基化的特异性一抗Anti-Histone H3(dimethyl K27)(1:200)4-C过夜；室温下用含0.1%Tween-20的PBS漂洗3次；加入二抗山羊抗兔抗体(1:1000,),避光室温孵育1h；去除二抗山羊抗兔抗体,加入DAPI染色液室温作用15min以上,用含0.1%Tween-20的PBS漂洗3次,荧光显微镜进行观察。 1.4统计分析方法采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,灰度值比值的计算采用单因素方差分析,组间差异方差齐时采用LSD,方差不齐时采用Dunnett T3检验方法比较。P值0.05为差别有统计学意义。 2.结果 2.1BMDLSC的形态变化密度梯度离心后获得比较均一的球形单个核细胞,经磁珠分选后,获得纯化的Thy-1(+) Lin (-) BMDLSC,未贴壁状态下细胞分散良好,椭圆透明,形态大小均一,未见明显混杂细胞或死细胞。而后光镜下动态观察培养,发现原代细胞的贴壁伸展时间大多在培养后48h内。诱导7d时观察,细胞呈现长梭型、多边型,密集排布,有少部分细胞凋亡漂浮。诱导14d时观察,细胞进一步变短,以类圆形、圆梭形为主。 2.2流式细胞术示分选后的细胞表面分子标志物纯度流式细胞仪结果提示表达Thy-1细胞表型的细胞纯度为99.63%,表达CD45细胞表型的细胞纯度为0.79%。 2.3不同分化时间的BMDLSC的ALB、AFP mRNA表达在免疫磁珠分选后以RT-PCR检测目标细胞ALB mRNA含量,未见明显条带。诱导7d时,可检测到ALB mRNA表达明显增多,电泳条带显示清晰。诱导14d, ALB mRNA明显较7d时增加明显,电泳条带高亮,提示目标细胞BMDLSC ALB mRNA表达高。以ALB mRNA条带与内参β-actin的灰度值比值为纵坐标,诱导时间为横坐标作图,可见ALB mRNA表达量整体呈现递增趋势。ALB mRNA灰度值比值示Od、7d、14d两两之间差别均有统计意义(P0.05)。检测Od目标细胞BMDLSC AFP mRNA含量,未见明显条带。诱导7d时,可检测到AFP mRNA表达明显增加,电泳条带显示清晰。诱导14d,AFP mRNA的表达较诱导7d时下降,但仍明显比未诱导AFP mRNA表达高。以AFP mRNA条带与内参β-actin的灰度值比值为纵坐标,诱导时间为横坐标作图,可见AFP mRNA表达量整体呈现先升高后下降趋势。AFP mRNA灰度值比值示0d、7d、14d两两之间差别均有统计学意义(P0.05)。 2.4不同分化时间H3K27me2的表达水平变化我们采用Western blot检测了H3K27me2的表达水平,结果显示,经分选后未诱导的目标细胞H3K27me2表达水平极低,诱导7d时表达增多。诱导14d,H3K27me2表达水平明显较7d时增加。以H3K27me2与内参β-actin的灰度值比值为纵坐标,诱导时间为横坐标作图,可见H3K27me2表达量整体呈现递增趋势,提示H3K27me2随着BMDLSC的分化,整体呈明显上升趋势,0d、7d、14d组间差异有统计学意义(P0.05)。在免疫荧光图中,我们看到了与Western blot结果相似,H3K27me2表达量呈现明显上升趋势。结论 1.体外诱导骨髓源性肝干细胞在体外向肝细胞定向分化的过程中,细胞内H3K27二甲基化的表达呈逐渐增强趋势,表明组蛋白H3的修饰参与该细胞向肝细胞定向分化的调控。 2.组蛋白修饰中H3K27二甲基化变化很可能是调控骨髓源性肝干细胞向肝细胞分化的一个重要环节或因素。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2

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