A2BAR在调控缺氧诱导肠粘膜屏障损伤中的作用及机制研究

发布时间：2017-11-09 21:19

  本文关键词：A2BAR在调控缺氧诱导肠粘膜屏障损伤中的作用及机制研究

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【摘要】：背景与目的 肠粘膜屏障是机体的重要屏障结构，包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障和化学屏障。其中机械屏障是最重要，也是最基础的屏障结构。各种急、慢性病理情况，如外科手术应激、战创伤、烧伤、炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)和全胃肠外营养(total parenteral nutrition, TPN)等均可导致肠粘膜屏障损伤，引发内毒素、细菌入血，进而引发全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，最终导致导致多脏器功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)[1]。尽管目前针对不同病理条件下肠粘膜屏障功能的调控机制做了大量研究工作，但在急、慢性病理条件下肠粘膜损伤及损伤后修复机制尚未阐明。 腺苷(Adenosine, Ado)是腺嘌呤核苷酸的前体和代谢产物，作为一种神经递质和调质，广泛分布于全身各系统及组织，调节着多种重要的生理及病理过程。在炎症反应、凝血过程、I/R或缺氧的条件下，细胞外腺苷浓度高度聚集，通过激活并结合细胞膜上的与G蛋白偶联的腺苷受体(Adenosine Receptor, AR)，从而启动一系列的信号转到过程。目前已发现AR有4种亚型,并已被成功克隆AR分为A1，A2A, A2B,A3腺苷受体。A1受体与Gi/G0蛋白偶联，A3受体与Gi蛋白偶联，抑制腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)的活性，减少环磷酸腺苷(cAMP)的水平；A2A、A2B与Gs蛋白偶联，激活AC的活性，增加cAMP的水平。低浓度的腺苷即可激活A2A受体，而只有较高浓度的腺苷才能激活A2B受体，提示在生理状态下基础水平的腺苷主要激活A2A受体，当腺苷水平上升超过生理水平或达到病理水平时A2B受体才被激活[2,3]。 A2B受体(Adenosine A2B receptor, A2BAR)参与调节机体多种生理及病理过程，包括活化肥大细胞、抑制血管平滑肌细胞的生长、刺激内皮细胞生长、舒张血管、调节炎症因子的释放、调节肠道氯离子分泌等[4,5,6,7,8]。研究发现，，急性缺血和缺氧条件可以诱发肠道A2BAR高表达[9]，进而参与调节缺血和缺氧对肠粘膜的损伤后修复的过程。而在IBD模型中，A2BAR/KO小鼠肠道损伤较WT小鼠轻，且A2BAR通过加强巨噬细胞分泌IL-6而起到促进肠道炎症作用[10]。对于A2BAR的在急、慢性病理条件中如何参与调控肠粘膜屏障功能的研究，目前仍不明确。因此，本课题拟建立I/R小鼠模型及体外肠粘膜屏障模型，应用蛋白印迹、激光共聚焦、U氏灌流系统、跨上皮电阻测定、RT-PCR等技术，探讨I/R条件下A2BAR的激活及失活对维持肠粘膜屏障功能关键的分子Claudin-1、Occludin、ZO-1等的表达及结构的变化。并通过U氏灌流系统及跨上皮电阻技术测定跨上皮电阻（TER），明确I/R条件及缺氧条件下A2BAR的激活与失活对肠粘膜屏障的调控机制，为肠粘膜屏障损伤及修复机制提供新的思路。 方法 1．建立小鼠肠道I/R损伤模型，通过免疫组织化学、蛋白印迹、RT-PCR及U氏灌流系统技术，测定小鼠肠粘膜中A2BAR的表达；利用阻断剂PSB1115抑制A2BAR表达后，观察Claudin-1、Occludin、ZO-1mRNA、蛋白表达水平及肠粘膜跨上皮电阻，了解I/R条件下A2BAR的失活如何影响肠粘膜紧密连接蛋白的表达及肠屏障功能。 2.建立肠上皮细胞系Caco-2缺氧及A2BAR抑制剂PSB1115干预模型，通过transwell小室培养肠上皮细胞、跨上皮电阻(TER测定技术，了解缺氧及PSB1115（A2BAR特异性抑制剂）干预情况下TER的变化情况。通过蛋白印迹、RT-PCR、激光共聚焦技术，检测常氧、缺氧及缺氧条件下PSB1115干预对肠上皮Claudin-1、Occludin、ZO-1表达及结构的影响。 3.建立肠上皮细胞系Caco-2模型，采用人结肠癌Caco-2细胞建立肠上皮细胞缺氧模型，分为常氧组、常氧加Forskolin（腺苷酸环化酶激动剂作用）组、缺氧8h组、缺氧8h加SQ22536(腺苷酸环化酶抑制剂)组；采用cAMP检测试剂盒，检测实验各组缺氧前后cAMP水平的变化； RT-PCR及Western-blot方法分别检测各组肠上皮紧密连接蛋白claudin-1及occludin mRNA和蛋白表达水平的变化；检测各组肠上皮TER的变化情况。探讨缺氧条件下环磷酸腺苷(cAMP)水平的变化对肠黏膜屏障功能的的影响。 主要结果 1．I/R条件下肠粘膜A2BAR表达量明显升高，术后6h达到峰值；I/R条件下肠道紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白水平都下降，肠粘膜TER值降低；而A2BAR特异性抑制剂PSB1115干预后， Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表达水平较单纯I/R组增多，且肠粘膜TER值升高。 2.单纯缺氧可以刺进体外培养肠上皮Caco-2细胞A2BAR表达量增加；缺氧引起紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表达水平下降，并且紧密连接结构破坏，同时上皮细胞TER明显降低；而A2BAR特异性抑制剂PSB1115缓解了缺氧条件引起的肠上皮屏障功能损害，肠上皮细胞紧密连接蛋白表达增多，且促进跨上皮电阻TER恢复。 3.缺氧条件下cAMP水平升高，抑制cAMP水平可增加肠道紧密连接蛋白claudin-1及occludin mRNA及蛋白水平的表达；且缺氧条件下cAMP水平的下调，可以减少缺氧对肠上皮屏障的损伤。 结论 1、I/R条件下肠粘膜A2BAR表达明显增加；Claudin-1、Occludin和ZO-1表达降低；肠粘膜跨上皮电阻明显降低；I/R条件下抑制A2BAR表达，Claudin-1、Occludin和ZO-1表达增多，且促进了肠粘膜跨上皮电阻升高。提示I/R条件下A2BAR通过调控肠上皮间紧密连接蛋白的表达及功能来影响肠上皮屏障功能。 2.缺氧条件下肠上皮A2BAR表达明显增加；缺氧造成Claudin-1、Occludin和ZO-1表达降低，结构出现破坏；同时造成肠上皮细胞跨上皮电阻降低。缺氧条件下抑制A2BAR表达，可以引起紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表达增多，缓解了紧密连接蛋白结构的破坏，同时肠上皮细胞跨上皮电阻TER明显增高。 3、常氧条件下肠上皮细胞cAMP表达较少，缺氧能显著升高cAMP水平。缺氧条件下利用腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536抑制cAMP水平，可以缓解缺氧引发的紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin的表达降低和肠上皮细胞跨上皮电阻TER的降低。提示缺氧条件下可以通过抑制细胞膜上A2BAR表达来降低细胞内cAMP水平，从而可以促进缺氧条件下肠上皮间紧密连接蛋白的表达，从而影响并调控肠上皮屏障功能。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【参考文献】

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1 吕豪;刘建春;于华;张英;王京;翟丽;;肠道缺血再灌注损伤中CD4~+ T细胞的激活及其与肠上皮细胞的相互作用[J];武警医学;2007年08期

2 陈立军,尉承泽,宋旭华,赵立,孟宪钧;抗内毒素单抗下调脓毒症小鼠肠上皮细胞白细胞介素-1转换酶基因表达及逆转肠上皮细胞凋亡的作用[J];中华实验外科杂志;2003年02期

3 丁连安,黎介寿,李幼生,朱念庭,刘放南,谭力;创伤及内毒素对大鼠肠屏障功能的损害[J];中华实验外科杂志;2004年06期

本文编号：1163634