HDAC5在小鼠胚胎干细胞胚层分化以及体细胞重编程中的作用

发布时间：2017-11-10 06:06

  本文关键词：HDAC5在小鼠胚胎干细胞胚层分化以及体细胞重编程中的作用

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【摘要】：在再生医学中，人们可以通过移植自体或配型相符的异体干细胞的方式来实现修复、替代或再生受损或病变的细胞、组织和器官。另外产生于体细胞重编程的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）也为干细胞的替代治疗,疾病发病机制的研究和新药的测试提供了另外一种潜在的资源，同时还可以规避用胚胎干细胞研究所涉及的伦理问题。 胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES cells）和诱导多能干细胞因在模拟及治疗人类疾病方面的重大研究意义和广阔的应用前景而成为近年的研究热点。越来越多的研究表明，表观遗传学修饰对胚胎干细胞多能性状态的维持、细胞谱系特异性的决定以及体细胞的重编程都起着至关重要的作用。而且表观遗传学中的组蛋白修饰可以控制基因的转录激活与抑制，其中乙酰化是最为重要的修饰方式之一。一般来说，核心组蛋白的乙酰化水平增高与转录激活有关，反之则与抑制相关。而维持核心组蛋白乙酰化水平的稳定有赖于组蛋白乙酰化酶（histone acetylases, HATs）和去乙酰化酶（histone deacetylases, HDACs）活性的平衡。 HDACs作为维持组蛋白乙酰化平衡的关键酶，凭借其转录抑制作用在介导一系列诸如：生长，死亡，分化，发育以及免疫反应等生物学事件中起着非常重要的作用。根据与酵母去乙酰化酶的同源性关系，HDACs被分成4个不同的家族。其中II类HDACs因其表达的组织特异性，而可能参与组织细胞的分化和发育，多项研究表明该家族成员HDAC5可在肌细胞分化、心肌发育、血管生成以及免疫反应过程中发挥重要调控作用。 研究目的： 既然HDAC5参与到细胞的分化以及发育的调控，那么在胚胎发育的早期，HDAC5是否就已经参与相关调控了呢？由于ES细胞是对应于体内早期胚胎置入后的外胚层细胞，其分化模拟许多与胚胎发育有关的事件。因此通过探讨HDAC5在ES细胞多能性状态的维持以及分化中所起的作用，可以更深入地了解胚胎发育早期所涉及的一些分子调控机制，为干细胞的应用研究奠定基础。 另外，iPS细胞因与ES细胞的生物学相似性，而有望成为ES细胞很好的替代物。但是通过体细胞重编程产生iPS细胞的过程需要消除体细胞固有的表观遗传学标记并建立新的针对干细胞特征的标记,因此通过探究HDAC5在小鼠体细胞重编程中所起的作用，为早日解决重编程中所面临的问题提供一些新的思路。 因此本研究分为两个部分，分别探讨HDAC5在ES细胞多能性维持、胚层分化以及体细胞重编程中的作用。 研究方法： 1.检测HDAC5对小鼠ES细胞自我更新的影响 本部分采用小鼠ES-E14TG2a胚胎干细胞系作为研究模型，首先分别建立HDAC5稳定下调和过表达的小鼠ES细胞系，然后通过形态学观察、碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，ALP)染色、多能性相关基因的检测和克隆形成能力的评估来评价HDAC5对ES细胞自我更新能力的影响。 2.检测HDAC5对小鼠ES细胞胚层分化的影响 分别将下调和上调HDAC5的小鼠ES细胞系进行体外分化（自发分化形成拟胚体）和体内分化（自发分化形成畸胎瘤），并通过检测相关胚层标志基因的表达和观察胚层分化的组织形态来评价HDAC5对小鼠ES细胞胚层分化的影响。 3.明确HDAC5在小鼠体细胞重编程中的作用 采用Yamanaka四因子诱导小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）重编程的经典方法，并在诱导起始阶段加入HDAC5的shRNA的策略，在诱导结束后检测形成iPS细胞的效率从而判断HDAC5对重编程的影响。 4.检测HDAC5对体细胞重编程中MET期的影响 通过下调HDAC5后检测MET（Mesenchymal-to-Epithelial Transition，间质—上皮样细胞的转化）期标志性基因的表达变化，从而揭示HDAC5参与重编程调控的机制。 实验结果： 1. HDAC5对小鼠ES细胞自我更新的影响 不管是下调或是上调HDAC5的表达，实验组和对照组在细胞形态、碱性磷酸酶染色，多能性相关基因表达以及克隆形成能力方面都没有差异。 2. HDAC5对小鼠ES细胞胚层分化的影响 通过体内外分化实验发现：下调HDAC5促进小鼠ES细胞向中胚层分化，同时抑制其向外胚层的分化，而内胚层不受影响；相反，上调HDAC5促进外胚层分化的同时抑制中胚层的分化，内胚层仍然不受影响。 3. HDAC5在小鼠体细胞重编程中的作用 重编程结束后通过计数碱性磷酸酶染色阳性和GFP阳性的克隆发现：下调HDAC5后严重影响重编程的效率。 4. HDAC5对体细胞重编程过程中MET的影响 检测MET期标志基因的表达表明：下调HDAC5后上皮样标志基因的表达受到抑制，，而间质样标志基因则处于异常激活状态。 实验结论： 1. HDAC5不影响小鼠ES细胞自我更新的维持。 2. HDAC5的表达变化影响小鼠ES细胞的胚层分化。 3. HDAC5是小鼠体细胞重编程所必需的关键调控因子。 4. HDAC5通过影响MET参与体细胞重编程的调控。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R321

【参考文献】

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1 Chia-Lin Wei;;Tackling the epigenome in the pluripotent stem cells[J];遗传学报;2008年07期

本文编号：1165369