从中医“圆道”理论探讨模拟微重力对骨髓间充质干细胞形态及功能的影响

发布时间：2017-11-10 21:20

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【摘要】：骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs）因其自身的优点被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞，其研究从属于前景开阔的再生医学领域，目前世界上有越来越多的学者投身到干细胞的研究中来，然而干细胞在临床运用的低效率与高风险是制约其广泛运用于临床的瓶颈，如何能从干细胞本身着手提高干细胞的分化潜能使其高效安全的运用于临床是摆在研究者面前的难题。 近年来，随着航空航天事业的迅猛发展，诸多研究人员将研究手段发展到太空领域，并逐步认识到微重力会对生物体的生理功能产生巨大的影响。微重力在细胞水平的作用也已引起了研究者的广泛关注。研究表明诸多细胞在模拟微重力环境(simulated microgravity,SMG)下可以呈现一种圆形改变，《内经》云“盖有诸内者，必形诸外”，细胞这种形态的改变必然会对其功能行为产生巨大的影响，在中医圆道理论的指导下，我们推测模拟微重力为骨髓间充质干细胞提供一种平衡、圆融的环境，这种环境更有利于干细胞保持其自身的特性。为了证明此种推测，本实验研究模拟微重力干预对骨髓间充质干细胞形态及增殖、分化、迁移等能力的影响，从而从干细胞本身着手，为临床获得高质量、高诱导效率干细胞提供新的手段，本研究首次以“圆道”理论为指导提出模拟微重力处理这一促进干细胞增殖、分化的新手段，为干细胞早日应用于临床提供新的思路。 实验一模拟微重力对BMSCs形态的影响 1.目的 研究SMG干预对BMSCs形态及细胞骨架的影响。 2.方法 BMSCs体外原代分离培养后，流式细胞术进行表面抗原鉴定，再将BMSCs随机分为正常重力（NG）对照组与模拟微重力（SMG）48h、72h和120h组，，光学显微镜下观察各组BMSCs形态的改变，荧光染色观察各组细胞骨架蛋白F-actin的变化。 3.结果 流式分析结果显示原代培养的BMSCs表达CD44、CD90阳性（阳性率分别为94.74%和93.57%），表达CD34和CD45阴性。光学显微镜下可见细胞在SMG干预后形态变圆，随着SMG处理时间的延长，细胞的宽/长比值越接近1，这种形态的圆形改变在SMG刺激72h时最明显，微重力处理时间延长至120h与SMG72h相比较，形态的改变没有统计学意义。鬼笔环肽染色发现短时间的SMG干预可使细胞骨架张力下降，细胞骨架弥散，使细胞形态呈现圆形改变，随着微重力处理时间的延长，细胞骨架有重组迹象。 4.结论 BMSCs在SMG干预后可以呈现形态的“归圆”改变，这种形态的改变是通过SMG调整细胞骨架实现的。 实验二模拟微重力对BMSCs功能的影响 1.目的 研究SMG干预后形态改变的BMSCs增殖、凋亡、多潜能分化能力和迁移能力的变化。 2.方法 将三代骨髓间充质干细胞随机分为NG组和SMG组(72h),研究： 2.1.增殖能力：①BrdU标记法检测两组细胞BrdU阳性率。②两组细胞在培养0、3、7天后,对细胞进行计数绘制细胞生长曲线,观察细胞增殖情况。③流式细胞术检测两组细胞的凋亡率。 2.2.多潜能分化能力：①Quantitative PCR及Western Blotting检测干细胞多潜能标志OCT4的表达。②将两组细胞在正常重力下分别进行内皮方向的诱导分化后,免疫荧光染色及Western Blotting检测两组细胞VWF及CD31的表达；脂肪方向的诱导分化后,光镜下观察油红O染色阳性表达率,Western Blotting检测PPAR/2在各组细胞蛋白水平的表达情况；神经方向的诱导分化后,免疫荧光染色及Western Blotting检测两组细胞MAP2及NF-H的表达情况。③随后研究BMSCs在SMG环境中诱导分化能力的变化：将BMSCs在SMG条件下培养72h后,在SMG环境中分别进行脂肪方向和神经方向诱导后,重新检测上述相关指标的变化。 2.3.迁移能力：①细胞划痕实验测定两组细胞划痕后0h、24h、48h、72h划痕的宽度。②Western Blotting检测两组细胞CXCR4的表达情况。 3.结果 3.1.增殖能力：①SMG组细胞BrdU阳性率较对照组增高(P0.05)。②BMSCs生长曲线显示,在培养第3天和第7天时,SMG组细胞数量均较NG组增多。③流式细胞术显示不同SMG组BMSCs与NG组BMSCs凋亡率无显著差异。 3.2.多潜能分化能力:①Quantitative PCR和Western Blotting结果表明OCT4在SMG组细胞中表达上调,SMG72h组升高最明显。②在正常重力下内皮方向的诱导结果表明：SMG组细胞VWF和CD31的表达量均较NG组增高。脂肪方向诱导结果表明：SMG组油红O染色阳性表达率(47%)明显高于NG组(18%),Western Blotting结果显示PPARγ2在SMG组的表达较NG组上调具有统计学意义。神经方向诱导结果表明：SMG组细胞MAP2和NF-H的表达量上调较NG组均具有统计学意义。③BMSCs在SMG环境中诱导分化能力的变化：两组BMSCs在正常重力条件下诱导后,OCT4仅有微量表达,而细胞在SMG环境中脂肪方向诱导后,细胞油红O染色阳性率极低(2%)且PPARy2的表达量极少,但OCT4表达较前两组升高(P0.05)。SMG环境中神经方向诱导后细胞MAP2及NF-H的表达量极少,但OCT4表达增多。 3.3.迁移能力：①细胞划痕实验显示与NG组相比,SMG组在划痕0h、24h、48h、72h后细胞划痕距离差异无统计学意义。Western Blotting结果分析,两组细胞CXCR4的表达差异无统计学意义。 4.结论 4.1.SMG处理可以促进BMSCs的增殖,且不会诱发凋亡 4.2.模拟微重力处理后形态“归圆”的BMSCs多潜能分化能力增强,其向内皮、脂肪、神经方向的分化能力均有所提高,且这种诱导分化能力的提高可能是与微重力环境促进干细胞更好的保持其未分化的状态相关。 4.3.研究结果尚未证实模拟微重力处理可以影响骨髓间充质干细胞的迁移能力。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329

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