青霉素G诱导的Cps持续性感染对相关基因表达及宿主细胞凋亡的影响

发布时间：2017-11-12 01:09

  本文关键词：青霉素G诱导的Cps持续性感染对相关基因表达及宿主细胞凋亡的影响

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【摘要】：目的： 建立鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci，Cps）持续性感染人子宫颈癌上皮细胞（HeLa细胞）的体外研究模型，分析Cps持续性感染对Cps相关基因的mRNA表达水平及宿主细胞凋亡的影响，初步探讨Cps持续性感染的分子机制。 方法： 在MOI为2的Cps感染体外培养的HeLa细胞2h之后，更换含有不同浓度青霉素G的新鲜衣原体培养基继续培养细胞48h，通过间接免疫荧光染色法对Cps的感染能力进行分析，确定青霉素G诱导Cps持续性感染的最佳诱导浓度。在青霉素G诱导Cps持续性感染24h或48h之后，分别采用免疫荧光染色技术和透射电子显微镜计数检测包涵体的形态学变化特征，并研究去除青霉素G后，Cps重新恢复其感染性的能力。从Cps全基因序列中挑选10个与Cps的复制、分裂、代谢、膜结构等相关的基因（DnaA、DnaK、FtsW、FtsY、GrpE、RpsD、IncC、OmcB、CPSIT_0846、CPSIT_0042），采用实时定量RT-PCR（qRT-PCR）技术检测持续性Cps感染期间衣原体基因的mRNA在不同时间点（6h、12h、24h、48h、72h）的表达水平差异。16S rRNA作为内参基因。另外，在青霉素G诱导Cps的持续性感染24h之后，用1μM凋亡诱导剂Staurosporine和溶媒对照处理细胞4h，并采用DNA Ladder法、AO/EB染色、Hoechst33258染色，以及流式细胞术对细胞的凋亡水平进行分析。 结果： （1）用青霉素G处理Cps感染的细胞，，可诱导Cps出现持续性感染，其最佳青霉素G诱导浓度为100U/mL。 （2）持续性感染状态下，Cps的包涵体形态特征较急性感染明显不同。在急性感染组中，Cps包涵体较大且形态多样，包涵体内存在大量致密的EB颗粒和少量RB颗粒；而持续性感染组，衣原体的包涵体偏小且外形偏圆，包涵体内的EB颗粒少见或不见，并出现部分异常膨胀变大的RB颗粒;去除青霉素G后，Cps可部分恢复其感染性。 （3）与Cps急性感染相比较，在持续性感染状态下Cps基因的转录水平发生了改变：FtsW、FtsY和CPSIT_0042等基因的mRNA表达水平明显下调（P值0.01），DnaA、DnaK、GrpE、RpsD、IncC和CPSIT_0846等基因转录水平明显上调（P值0.05），而OmcB等基因的转录水平几乎没有发生明显变化（P值0.05）。 （4）在凋亡诱导剂Staurosporine处理下， Cps持续性感染细胞的的凋亡率明显低于未感染细胞（P值0.01），但高于Cps急性感染的细胞（P值0.05）。 结论： （1）成功构建了由青霉素G诱导的Cps持续性感染的体外细胞模型。 （2）持续性感染期间，Cps基因DnaA、DnaK、GrpE、RpsD、IncC、CPSIT_0846、FtsW、FtsY、CPSIT_0042等的mRNA表达水平发生了明显的变化，这可能与Cps持续性感染期间包涵体的形态学特征改变有关。 （3）Cps持续性感染可增强细胞的抗凋亡能力，但持续性感染对细胞抗凋亡的能力的影响不及Cps急性感染。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R374

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本文编号：1173661