MG-132对SY5Y细胞中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子CD147表达的影响

发布时间：2017-11-12 17:03

  本文关键词：MG-132对SY5Y细胞中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子CD147表达的影响

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【摘要】：目的：细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, CD 147)是种跨膜糖蛋白,能够通过刺激成纤维细胞分泌基质金属酶类(Matrix metalloproteinases, MMPs)的表达,促使肿瘤细胞周围细胞外基底膜和间质成分降解,从而有利于肿瘤的侵袭、转移和扩散。随着人们对CD147研究的进一步深入,发现其可在多种组织和细胞中表达,并且不仅与肿瘤的发生发展密切相关,而且还可参与视黄醛功能、胚胎发育、胸腺T细胞发育以及其他正常生理过程。研究表明,MMP抑制剂对于治疗肿瘤的成效不是十分理想,而以作用于MMP诱导剂的CD147为靶目标的治疗方式可能是一种有效的技术方法。该方法可通过抑制CD147的表达来抑制MMP的分泌及其活性,从而为与MMP相关疾病的治疗提供新的方向策略。于是,如何调控、影响CD147的表达成为了有待于解决的问题关键。目前,对于CD147的结构、功能、相互作用蛋白等有了较为广泛的了解,但对其表达调控、降解途径的研究还没有较为清晰的报道。生成与降解均可影响蛋白含量的水平。在真核细胞内,泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway, UPS)是一条主要的蛋白降解通路,介导的蛋白降解是机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个重要机制,细胞内约80%以上的蛋白均经此途径降解。在调整细胞周期、控制信号转导和调节细胞凋亡过程中起着至关重要的作用,成为治疗肿瘤的靶点,如果通路出现异常则会导致疾病的发生,但CD147是否也与此降解途径相关目前还不十分清楚。研究CD147的作用机制以及其信号传导过程,以求探索阻断其传导或有效抑制其作用的有效方法,也许将能为我们提供一条有效的遏制恶性肿瘤、神经退行性疾病的新路径。MG-132是种醛基肽类蛋白酶体抑制剂,是第一类被发现和广泛应用的蛋白酶体抑制剂,可以抑制20S催化颗粒中类糜蛋白酶活性,阻止蛋白酶体对泛素化蛋白的降解。因此,本实验在此基础上,利用蛋白酶体抑制剂MG-132对SY5Y细胞进行干预,利用两种不同的实验方法westernblot和in-cell western分别检测,观察蛋白酶体抑制剂MG-132对CD147表达的影响,初步探讨CD147的降解途径,为寻找与CD147相关的肿瘤性疾病治疗提供理论依据和方向策略。方法：1实验材料人神经母细胞瘤SH-SY5Y,90% DMEM,10%胎牛血清,37℃,5%CO2培养,5-7天传代。2 Westernblot接种于6孔板内,不同浓度蛋白酶抑制剂MG-132(0,1,2.5和5μmol/L)培养24 h后,RIPA裂解,经超声破碎4℃低温离心,吸取上清,蛋白变性,；加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳、转膜、封闭；加入检测抗体CD147/GAPDH,4℃摇动过夜；漂洗后加入荧光二抗孵育；Odyssey双色红外激光成像仪扫描,以仪器自带软件对各孔吸光度值进行测量。3 In-cell western接种于96孔板内,不同浓度蛋白酶抑制剂MG-132(0,1,2.5和5μmol/L)培养24 h后Odyssey双色红外激光成像仪扫描,以仪器自带软件对各孔吸光度值进行测量。4免疫双标染色观察24孔板培养SY5Y细胞48h,4%多聚甲醛固定0.5h。PBS充分清洗后山羊血清封闭2h。加入CD147一抗和ubiquitin一抗共孵育过夜,第二天清洗后分别加入荧光二抗Dylight 488/Dylight 594,利用奥林巴斯全能显微镜观察二者在细胞中的分布及定位情况。结果：1 Westernblot检测,在一定时间内,随着MG-132浓度的增大,CD147的含量相对增多；与0μmol/L组比较,5μmol/L组的CD147含量增加了约151.81±36.26%(P0.05)。2 In-cell western检测,在一定时间内,随着MG-132浓度的增大,CD147的含量相对增多；与0μmol/L组比较,5μmol/L组的CD147含量增加了约76.43±18.02%(P0.05)；3 CD147与ubiquitin在胞体中存在共定位的特征。结论：1蛋白酶体抑制剂MG-132可影响CD147的表达,呈正相关性。2推测MG-132可能通过抑制CD147的降解来增加其表达含量。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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1 宋长征;;泛素-蛋白酶体通路的转化研究进展[J];济南大学学报(自然科学版);2013年03期

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本文编号：1176784