皮层细胞低氧条件液对神经干细胞增殖和分化的影响及信号转导机制的研究

发布时间：2017-11-15 13:01

  本文关键词：皮层细胞低氧条件液对神经干细胞增殖和分化的影响及信号转导机制的研究

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【摘要】：研究目的 本研究旨在分析大鼠大脑皮层细胞不同低氧浓度条件液对神经干细胞(neural stem cells, NSCs)增殖和分化的影响，并探讨PI3-K和JNK这两条信号转导通路在此过程中发挥的作用。研究方法 本研究主要分为五个部分：⑴低氧条件液的制备。分离新生24h内的SD大鼠大脑皮层细胞并进行原代培养，，以密度(6.5 7.0)×105细胞/ml，接种于预先用0.01%多聚赖氨酸包被的24孔板中，培养5d后进行全量换液，并放入4%O2、1%O2和常氧浓度(20.96%O2)环境下继续培养细胞6h以制备低氧条件液和常氧条件液。⑵观察和分析低氧条件液对NSCs增殖的影响。分离生后24h内的SD大鼠大脑皮层NSCs，以密度(6.0 6.5)×105细胞/ml接种于48孔板中。实验组用低氧条件液培养，对照组用常氧条件液培养。培养24h后计数神经球，以分析NSCs的增殖效率，分别于培养24h、48h和72h三个时间点测量神经球直径，以分析NSCs的增殖速度；72h后进行Nestin免疫荧光染色鉴定。⑶观察和分析低氧条件液对NSCs分化的影响。NSCs分离于生后24h内SD大鼠大脑皮层，用Neurobasal培养基添加2%B27和20ng/ml bFGF悬浮培养，48h后获得NSCs增殖形成的神经球，将其转接到预先用0.01%多聚赖氨酸包被的48孔板中，待神经球完全贴壁后进行全量换液诱导NSCs分化。实验组用低氧条件液培养，对照组用常氧条件液培养。48h后使用免疫荧光双标法鉴定NSCs后代细胞表型，并分别计算每种表型细胞在后代细胞中所占的比例，以分析不同条件下NSCs的分化情况。⑷分析4%低氧条件液中抑制剂LY294002和SP600125对NSCs增殖的影响。NSCs分离方法同⑵，实验分为四组：①低氧条件液组；②DMSO组(向低氧条件液中添加DMSO，其终浓度为0.5%)；③LY294002组；④SP600125组。两种抑制剂使用前均用DMSO溶解，以10μmol/L终浓度加入低氧条件液中，DMSO终浓度为0.5%。细胞培养方法及神经球计数和直径测量方法均同⑵。⑸分析4%低氧条件液中抑制剂LY294002和SP600125对NSCs分化的影响。NSCs分离方法、细胞培养及计数方法均同⑶，实验分组方法同⑷。⑵⑶⑷中每组均设3个复孔，细胞置于37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱内培养，实验重复3次。 研究结果 1．低氧条件液对NSCs增殖的影响：①4%低氧条件液组和常氧条件液组NSCs的增殖效率高于1%低氧条件液组(P0.01)，但前两者之间没有差异；②与常氧条件液组相比，两个低氧条件液组均提高了NSCs的增殖速度(P0.01)，且4%低氧条件液NSCs的增殖速度较1%低氧条件液快(P0.01)。 2．低氧条件液对NSCs分化的影响：在三种条件液培养下NSCs分化出神经元的比例均高于星形胶质细胞的比例；与常氧条件液组比较，4%低氧条件液促进了NSCs向神经元方向分化(P0.01)，而1%低氧条件液则抑制了NSCs向神经元细胞方向分化(P0.01)。 3．4%低氧条件液中抑制剂LY294002和SP600125对NSCs增殖的影响：在4%低氧条件液中使用LY294002和SP600125同时抑制了NSCs的增殖效率和增殖速度，且LY294002抑制作用在24h之后尤为明显。 4.4%低氧条件液中抑制剂LY294002和SP600125对NSCs分化的影响：在4%低氧条件液中使用LY294002和SP600125均抑制了NSCs向神经元方向分化(P0.01)，且LY294002抑制作用较SP600125大(P0.01)。 研究结论 大脑皮层细胞4%氧浓度的低氧条件液能显著提高NSCs的增殖速度和促进大脑皮层NSCs向神经元方向分化，PI3-K信号转导通路在这两个过程中均发挥主要作用。
【学位授予单位】：上海体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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本文编号：1189831