HBV核心蛋白突变体重组质粒的构建及其拮抗IFN-α抗病毒机制的研究

发布时间：2017-11-18 02:01

  本文关键词：HBV核心蛋白突变体重组质粒的构建及其拮抗IFN-α抗病毒机制的研究

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【摘要】：目的构建HBV核心蛋白（HBc）突变体L60V，I97L，S85G重组质粒（pEGFP-L60V，pEGFP-I97L，pEGFP-S85G），以探讨HBV核心蛋白（HBc）拮抗α干扰素（IFN-）抗病毒活性及其相关机制。 方法以质粒p3.8Ⅱ为模板PCR法扩增HBc基因，与真核细胞表达载体pEGFP-N1连接构建pEGFP-HBc-WT，通过定点突变技术构建HBc突变体融合表达载体pEGFP-L60V，pEGFP-I97L，pEGFP-S85G；应用荧光显微镜及Western blot技术进行质粒鉴定。 将构建好的重组质粒通过脂质体分别转染人肝胚瘤细胞株HepG2细胞，运用荧光显微镜及Western blot法分析其在细胞中的表达及细胞亚定位；以RT-PCR及Western blot法检测JAK-STAT信号转导途径相关分子（STAT1、STAT2、IRF9、SOCS3）及抗病毒蛋白（MxA、PKR、2'，5'-OAS）的表达，并以Western blot技术分析HepG2细胞内NF-κB p65亚基的表达。 结果经酶切和测序分析，成功构建HBc突变体L60V，I97L，S85G重组质粒；将这三种突变体表达质粒（pEGFP-L60V，pEGFP-I97L，pEGFP-S85G）分别转染HepG2细胞后，以1,000IU/mL IFN-α处理，细胞内抗病毒蛋白MxA及JAK-STAT信号转导途径分子STAT1、STAT2、IRF9等呈低表达，其中转染pEGFP-I97L的HepG2细胞抗病毒蛋白及信号转导相关分子变化最为显著，SOCS3呈高表达；pEGFP-L60V，pEGFP-I97L，pEGFP-S85G转染HepG2细胞并经IFN-α处理后，，NF-κB p65蛋白表达显著降低。结论HBc及其突变体（L60V，I97L，S85G等）很可能通过影响JAK-STAT信号转导途径相关分子和抗病毒蛋白的表达从而拮抗IFN-α的抗病毒效应；NF-κB及SOCS3可能参与HBc突变体拮抗IFN-α的抗病毒效应。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373

【参考文献】

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1 李嘉,朱理珉,梁树人,李顺天,徐健;乙型肝炎病毒核心区基因变异与细胞免疫[J];中华肝脏病杂志;2003年09期

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本文编号：1198115