鞭毛蛋白FliC突变体作为HPV L2多肽抗原载体的初步研究

发布时间：2017-11-18 19:01

  本文关键词：鞭毛蛋白FliC突变体作为HPV L2多肽抗原载体的初步研究

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【摘要】：目前上市的以HPV主要衣壳蛋白L1为基础的病毒样颗粒(VLP)疫苗,主要诱发型别特异性中和抗体,仅可预防两种高危型病毒(HPV 16, HPV 18)感染相关的约70%的宫颈癌,对其他高危型诱发的约30%的宫颈癌缺乏有效保护,且.生产成本高。病毒次要衣壳蛋白L2N端区域(主要集中于aa.13-154区)含有多个交叉中和抗体表位,可诱发产生广谱保护反应,但L2N多肽及表位的免疫原性弱,因此增强L2N的免疫原性,可望提高L2N多肽疫苗的广谱免疫保护活性。鞭毛蛋白可以通过TLR5通路诱导炎症反应和树突状细胞(Dendritic cell, DC)的成熟,与抗原蛋白融合后免疫,可显著增强抗原特异的免疫反应及体内保护活性。流感病毒临床实验发现,全长鞭毛蛋白与HA1的胞外区融合蛋白虽可有效增强抗原的免疫原性,但个别受试者也出现了肌肉疼痛、发冷等不良反应。研究表明降低鞭毛蛋白自身抗体水平可以显著减少小鼠血清前炎性因子、血清转氨酶等的产生。鉴于HPV 18 DNA在宫颈癌中检出率仅次于HPV 16,且HPV 18感染肿瘤死亡率是HPV 16的2.4倍,因此本研究以HPV 18 L2 N多肽作为抗原,对鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC进行改造,在保留鞭毛蛋白的保守区,特别是保留TLR5的识别区域(ND1及CD1)的基础上,对可刺激产生鞭毛蛋白自身抗体的高变区(ND2+D3+CD2a+CD2b)进行不同程度的删除,获得fliC突变体；然后以此为L2N多肽抗原的载体,在大肠杆菌中表达获得各种FliC突变体/HPV18 L2 N融合蛋白,然后对其活性进行评价,筛选出免疫刺激活性强且诱发鞭毛蛋白自身抗体水平低的FliC突变体,用于L2多肽蛋白疫苗的研究。结果如下：1.采用overlapPCR方法分别获得了fliC△D3(删除D3)、fliC△D3CD2a(删除D3+CD2a)及fliC AD2D3(删除D2+D3)突变体基因,并将其克隆入pET22b表达载体,获得了鞭毛蛋白突变基因的原核表达载体。然后将18 L2N (aa.13-154)基因插入至fliC突变体删除区域,获得pET22b-fliC△D3/18 L2N. pET22b-fliC△D3CD2a/18 L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N表达载体。2.上述三种fliC突变体/18 L2N融合基因原核表达载体,转化BL21,30℃,0.5mM IPTG诱导表达。SDS-PAGE 及 Western blot检测表明三种FliC突变体/18 L2N融合蛋白均主要以包涵体的形式表达。经Ni-Sepharose层析、透析复性及Q-Sepharose HP层析(去除内毒素)步骤,获得三种FliC突变体/18 L2N融合蛋白。SDS-PAGE分析显示获得纯度均大于90%,鲎试剂凝胶法显示纯化蛋白的内毒素含量均低于50 EU/mg; Native-PAGE显示各融合蛋白均主要以单体形式存在。3.取等摩尔量的三种FliC突变体/18 L2N融合蛋白及18 L2N,小鼠皮下免疫三次,间隔两周。ELISA结果显示,第三次免疫两周后,三种FliC突变体／18 L2N融合蛋白免疫血清中FliC特异性抗体滴度均较18 L2N组的显著升高,且FliC△D3/18 L2N免疫组免疫血清中FliC特异性抗体滴度显著高于FliC△D3CD2a/18 L2N和FliC△D2D3/18 L2N免疫组。FliC△D2D3/18 L2N免疫组与FliC△D3CD2a/18 L2N免疫组小鼠血清中FliC特异性IgG抗体无显著性差异。4.体重变化观察发现18 L2N、FliC△D2D3/18 L2、FliC△D3CD2a/18 L2N免疫组小鼠体重均上升,只有FliC△D3/18 L2N免疫组小鼠在初次免疫后第一天体重下降,到第四天时体重恢复至与其他三组小鼠体重相近的水平。5.假病毒中和实验显示,,FliC△D2D3/18 L2N免疫组和FliC△D3/18 L2N免疫组的HPV 18血清中和抗体滴度均显著高于18 L2N免疫组。FliC△D3CD2a/18L2N免疫组中和抗体滴度较低,与18 L2N免疫组无显著性差异。本研究结果表明FliC△D2D3不仅可以降低鞭毛蛋白ELISA结合抗体,还可增强18 L2N诱发中和抗体的能力,提示FliC△D2D3可作为载体,用于HPVL2为基础的融合蛋白疫苗的研究。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

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