我国弓形虫优势基因型虫株诱导神经干细胞C17.2凋亡的机制研究

发布时间：2017-11-18 23:04

本文关键词：我国弓形虫优势基因型虫株诱导神经干细胞C17.2凋亡的机制研究

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【摘要】：目的研究流行于我国的弓形虫优势基因型（ChineseⅠ型）代表虫株TgCtwh3对神经干细胞凋亡水平的影响以及其分子机制。方法（1）C17.2神经干细胞系的复苏、培养、鉴定及与GFP-RH株弓形虫共培养体系的建立。复苏C17.2细胞，常规传代后，用神经干细胞特异性标记蛋白Nestin对其进行免疫荧光鉴定。运用transwell培养板，在下室中预先加入已计数的C17.2细胞，上室中加入GFP-RH株弓形虫速殖子，共培养不同时间后，，用荧光显微镜观察下室是否有GFP-RH速殖子以检测共培养系统的滤过效率。（2）与弓形虫共培养后C17.2细胞凋亡的检测。根据实验安排加入2×104、1×105、5×105个TgCtwh3速殖子，并设立对照组、速殖子热灭活组及阳性对照组，培养6h、12h、24h后，收集下室C17.2细胞，采用Annexin V-FITC/PI双染和免疫印迹法检测细胞凋亡水平和caspase-3的表达。（3）抑制剂预处理后，细胞凋亡水平及内质网应激通路中相关蛋白的检测。1mmol/L TUDCA预处理C17.2细胞6h后，在transwell上室中加入5×105个TgCtwh3速殖子，培养24h后收集下室细胞，流式细胞术检测细胞凋亡水平，免疫印迹法检测内质网应激信号通路中相关蛋白的表达水平。结果（1）C17.2细胞对神经干细胞特异性标志蛋白Nestin呈免疫阳性。Transwell共培养体系中，弓形虫速殖子无法穿过滤膜进入含C17.2细胞的下室中。（2）C17.2细胞与TgCtwh3株弓形虫速殖子共培养6h、12h、24h后，细胞凋亡率分别为9.62±1.02%、12.73±0.99%、15.6±1.35%，而此时对照组细胞凋亡水平分别为4.54±1.72%、5.25±1.27%、6.98±1.11%，速殖子热灭活组的细胞凋亡率分别为4.99±0.54%、6.29±2.08%、7.58±1.16%。以上结果发现，随着共培养时间的延长，细胞凋亡水平增加，且与对照组相比存在差异（P＜0.05）。热灭活组细胞凋亡水平与对照组无差异。（3）C17.2细胞分别与2×104、1×105、5×105个TgCtwh3速殖子共培养24h后，细胞凋亡率分别为7.87±2.01%、11.05±0.77%、14.87±0.96%，与对照组的4.8±1.32%相比存在统计学差异（P＜0.05），而且随着速殖子数量的增多，细胞凋亡水平亦随之增高。免疫印迹结果显示，弓形虫共培养组的caspase3被活化。（4）C17.2细胞与5×105个TgCtwh3速殖子和RH速殖子共培养24h后，凋亡率分别为12.52±0.11%、17.47±0.46%，二组之间有统计学差异（P＜0.05）。（5）内质网应激信号通路抑制剂TUDCA对C17.2预处理后，TgCtwh3共培养组和RH共培养组的C17.2细胞凋亡率分别为7.23±0.45%、9.93±0.16%，而TUDCA未处理的TgCtwh3共培养组和RH共培养组的细胞凋亡率分别为12.52±0.11%、17.47±0.46%，相比较发现，抑制剂预处理降低了细胞的凋亡水平（P＜0.05）。（6）WesternBlot结果显示，TgCtwh3和RH速殖子共培养组C17.2细胞中内质网应激信号通路关键蛋白caspase12、CHOP、p-JNK的表达上调。而TUDCA抑制剂预处理后，上述蛋白的表达明显下调（P＜0.05）。结论（1）中国优势基因型代表虫株TgCtwh3可通过其排泄分泌抗原诱导C17.2神经干细胞系的凋亡，凋亡水平呈时间和剂量依赖性，与RH诱导的凋亡水平相比存在显著性差异。（2）TgCtwh3可通过上调内质网应激信号通路中caspase12、CHOP、p-JNK蛋白诱导神经干细胞C17.2的凋亡。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R382.5

【参考文献】

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