临床分离铜绿假单胞菌株的临床分布特征及Quorum Sensing系统编码基因的研究

发布时间：2017-11-22 22:00

  本文关键词：临床分离铜绿假单胞菌株的临床分布特征及Quorum Sensing系统编码基因的研究

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【摘要】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginoisa, PA)为条件致病菌,也是引起医院内感染的主要致病菌之一。由于其极强的环境适应能力而分布广泛。PA主要侵袭免疫力低下或免疫功能受到抑制的患者,进而导致呼吸道感染、血液感染和尿路感染。近些年来随着抗菌药物的乱用、滥用使得抗菌药物的耐药率只升不降,再加上临床治疗中各种侵入性操作的增加,更是使得铜绿假单胞菌的耐药率上升情况雪上加霜,甚至出现多药耐药,给临床抗菌治疗带来许多困难。铜绿假单胞菌耐药机制复杂,其中之一就是细菌生物膜的形成。 目前,生物被膜研究成为当前的研究热点,大量文献显示,生物被膜是细菌形成感染的必备条件。密度感应(Quorum Sensing,QS)系统与生物膜的分化和成熟之间的关系非常亲密。铜绿假单胞菌的QS系统的缺失对细菌生物膜是否有影响?从分子生物学的角度来说是如何影响?本课题通过对铜绿假单胞菌QS系统缺陷株QS编码基因进行检测,探讨QS系统调控机制。试图从基因层面、配体分子层面等分子生物学方面对QS系统进行干扰,为临床抗感染寻求新的途径。 1、临床分离铜绿假单胞菌的多药耐药情况及临床分布特征 目的：从临床的角度出发,对某院临床分离铜绿假单胞菌主要标本类型及易感染科室的规律有个初步的了解,并检测PA的多药耐药情况。 方法：连续收集某院住院及门诊患者的痰、咽拭子、分泌物及血液等临床标本。所有菌株均经生物梅里埃公司VITEK-2重新鉴定；采用琼脂倍比稀释法测定菌株的MIC值,依据2012年版美国实验室标准化委员会(CLSI)推荐的铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的MIC值判定耐药性；将同时对≥3种抗菌药物耐药的菌株判定为多药耐药菌株；用WHONET5.5版本软件进行统计分析标本临床分布特征。 结果：(1)66株铜绿假单胞菌标本中检出率最高的是痰液64.94%(43/66),其次为分泌物14.29%(9/66),无菌体液中尿占到7.79%(5/66)、血液占到6.49%(4/66)、腹水占到1.3%(1/66)。(2)在临床科室中检出率居首位的是ICU和呼吸科,均为15.15%(10/66),居第二和第三的分别是血液科12.12%(8/66)和神经科、骨科9.09(6/66),风湿科、消化科、肾内科和普外科很相近,均在5%左右；(3)在MIC值得测定中,耐药率最高的抗菌药物为氨曲南(45.45%),其次为头孢哌酮/舒巴坦(39.39%),耐药率最低的为哌拉西林/他唑巴坦(9.1%),多药耐药菌株占到27.27%(18/66)。其中同时对丁胺卡那、美罗培南和氨曲南耐药的有9株,占到多药耐药菌株的50%；同时对左氧氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南耐药的有6株,占到多药耐药菌株的33.3%；同时对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南耐药的有5株,占到多药耐药的菌株的27.8%。 2.、临床分离铜绿假单胞菌QS系统缺陷株的筛选及生物被膜形成能力的分析 目的：探讨铜绿假单胞菌QS系统是否影响生物膜的形成。 方法：依据铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的产生严格依赖QS系统,弹性蛋白酶缺失的则为QS系统缺陷株。利用平板结合结晶紫染色法建立PA生物膜,并定量分析临床分离的铜绿假单胞菌生物被膜形成能力。 结果：66株菌中检测出有6株(27号、33号、38号、42号、62号、66号)QS缺陷株,检出率为9.09%(6/66),QS系统非缺陷株高达90.91%。缺陷株A570平均值=0.434,非缺陷株A570平均值=1.113,在非缺陷菌株中Amax=2.285, Amin=0.679。 3、临床分离铜绿假单胞菌QS系统编码基因分析 目的：从分子生物学出发,探索铜绿假单胞菌QS系统的编码基因是否存在异常,为临床治疗铜绿假单胞菌的感染寻求新的途径。 方法：用由宝生物(大连)有限公司提供的DNA提取试剂盒提取出铜绿假单胞菌染色体DNA,利用PCR试剂盒进行扩增,扩增产物做琼脂糖电泳实验初步判断铜绿假单胞菌QS缺陷株所缺的基因,然后进行DNA序列检测,用Bioedit软件将分离铜绿假单胞菌QS缺陷株与野生株PAO1的基因标准序列进行比对并转换成蛋白质的氨基酸序列与野生株PAO1进行比对。 结果：①电泳结果显示：27号菌株的rhlR、lasI基因缺失；42号菌株的lasI、 lasR、rhlI、rhlR四个基因均缺失；33、38、62、66号菌株的lasR基因均缺失。②基因比对和蛋白质的氨基酸序列比对结果显示：27号、33号、38号菌株的rhlR基因序列多个位点发生碱基替换突变,其中第402位、第597位的碱基突变使得编码蛋白氨基酸序列第130个、第195个氨基酸由异亮氨酸、苯丙氨酸分别变为苏氨酸、丝氨酸,此外38号菌株的rhlR基因序列在第696位发生碱基缺失(移码)突变、697位发生碱基替换突变使得第113个氨基酸由络氨酸变为丝氨酸。33号、38号菌株的rh1I基因发生多位点突变,其中第118位碱基替换突变使得第35个氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸,62号和66号菌株的rh1I基因序列发生多位点突变,其中第85位、第266位碱基替换突变使得第24个、第88个氨基酸由精氨酸、蛋氨酸分别变为半胱氨酸、亮氨酸。 结论： 1、人体呼吸道最容易受到铜绿假单胞菌的侵袭,ICU和呼吸科的患者是铜绿假单胞菌感染的高危人群,是重点监控的对象。对铜绿假单胞菌最敏感的为哌拉西林/他唑巴坦,同时,铜绿假单胞菌的多药耐药多见于丁胺卡那、美罗培南、氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦的使用,选择药物时,应避免重复。 2、铜绿假单胞菌临床分离株大部分是QS系统功能正常菌株,具有生物膜形成能力。 3、铜绿假单胞菌QS缺陷株的生物膜形成能力明显降低。 4、铜绿假单胞菌QS系统编码基因存在高突变区,基因突变导致编码蛋白质的氨基酸序列发生改变。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.991

【参考文献】

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本文编号：1216160