刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建

发布时间：2017-11-23 14:28

  本文关键词：刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建

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【摘要】：目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒p VAX1-ROP18和p VAX1-ROP12分别经Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至p VAX1-ROP18重组质粒。经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒p VAX1-ROP18-ROP12转染至He La细胞。同时设空质粒组、p VAX1-ROP18转染组和p VAX1-ROP12转染组。提取各组He La细胞的总RNA并逆转录为c DNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12瞬时转染He La细胞后蛋白的表达情况。结果重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符。提取重组质粒经HindⅢ、Bam HⅠ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确。测序结果显示,p VAX1-ROP18-ROP12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100%,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99%。脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符。p VAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带。间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的He La细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光。Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000。结论构建了重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达。
【作者单位】： 河北北方学院病原生物与免疫学研究所;
【基金】：河北省自然科学基金项目(No.H2013405091) 河北省高等学校科学技术研究重点项目(No.ZH2012010) 河北北方学院校级重大课题(No.ZD201312) Supported by Hebei Province Natural Science Fund(No.H2013405091) the Key Research Projects of Hebei Higher School Science and Technology(No.ZH2012010) the Major Issue of Hebei North University(No.ZD201312)
【分类号】：R382.5
【正文快照】： (Institute of Pathogen Biology and Immunology,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China)Supported by Hebei Province Natural Science Fund(No.H2013405091),the Key Research Projects of Hebei Higher School Scienceand Technology(No.ZH2012010),and the Ma

【共引文献】

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6 米东;祁s，

本文编号：1218714