体外长期传代培养对人脐带间充质干细胞造血支持能力的影响

发布时间：2017-11-25 01:10

  本文关键词：体外长期传代培养对人脐带间充质干细胞造血支持能力的影响

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【摘要】：研究背景： 间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是一类源于发育早期中胚层和外胚层的多能干细胞。目前，研究者们已从骨髓、脂肪、肌肉、滑膜、脐带、胎盘组织等各种组织中分离获得MSCs，其中人脐带来源MSCs（hUC-MSCs）现已成为目前更理想的MSCs来源之一。早期有研究发现，MSCs是骨髓造血微环境重要组成成分，在造血支持中发挥重要作用，其能够促进HSC植入、重建造血微环境。此外，MSCs还具有多向分化能力、免疫调节能力等独特的生物学特性，因而为其实验研究以及临床应用提供了重要的前提条件，日益备受学者们的关注。然而，人体组织MSCs含量较低，目前无法满足临床治疗应用的需求，因此，体外长期传代培养成为临床大量应用MSCs的必要前提。据研究报道，体外传代培养后MSCs生物学特性会发生一定改变，而目前关于长期传代培养对MSCs造血支持能力影响的研究甚少，因此探究体外长期传代培养对MSCs造血支持能力的影响有重要意义。 目的： 分离、培养人脐带间充质干细胞，探究其条件培养基的造血支持能力。同时长期体外传代培养人脐带间充质干细胞，比较高、低不同代次人脐带间充质干细胞的细胞形态、增殖能力的差异，重点比较高、低不同代次人脐带间充质干细胞条件培养基造血支持能力的差异，以及存在差异的分子机制。 方法： 收集新生儿脐带组织，我们采用胶原酶消化法对人脐带组织进行分离，应用贴壁细胞培养的方法纯化原代人脐带间充质干细胞，并且在体外进行人脐带间充质干细胞长期传代培养。通过细胞形态观察、免疫荧光标记分析细胞表型以及使用不同的诱导分化培养体系检测其多向分化的能力，鉴定分离提纯的细胞是否为间充质干细胞。应用MTT比色法分析比较经过长期传代培养高、低不同代次人脐带间充质干细胞的增殖情况，，同时用流式细胞仪对其进行细胞周期检测。标准的培养体系下，收集高、低不同代次人脐带间充质干细胞培养上清做为条件培养基，使用条件培养基进行造血集落形成实验。通过real-timePCR检测高、低不同代次人脐带间充质干细胞造血相关细胞因子的表达量，并应用ELISA检测条件培养基中造血相关细胞因子的含量。 结果： 分离纯化获得的细胞贴壁生长，呈典型的成纤维细胞形或纺锤形。流式细胞术检测，其表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166，而CD19、CD31、CD34、CD45、CD106、HLA-DR细胞表面标记为阴性。在诱导分化体系下，细胞可以向成骨细胞、脂肪细胞分化。以上结果证实我们所得到的细胞为间充质干细胞。人脐带间充质干细胞条件培养基能够在体外发挥支持造血的功能，其可支持造血干/祖细胞主要向除红细胞系以外的髓系细胞分化(CFU-G47.67±0.58、CFU-GM48.67±4.73、CFU-M3.00±2.00)。长期体外传代培养后，高代次（第30代）的人脐带间充质干细胞的细胞形态略发生改变，细胞体积变大。其细胞周期检测结果提示，85%以上细胞处于G0/G1静止期。MTT法分析得到的增殖曲线表明，与低代次（第3代）细胞相比，高代次细胞的增殖能力显著下降。但其形成的集落形成单位数量（251.67±25.27）显著比低代次细胞所形成的数量（60.00±3.61）多，差异具有统计学意义（P0.05），并且高代次细胞中造血相关细胞因子G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-6等的相对表达量显著高于低代次细胞的表达量。该结果证明经过长期传代培养后人脐带来源间充质干细胞条件培养基的造血支持能力增强。 结论： 我们从人脐带中分离纯化获得间充质干细胞，其体外培养的条件培养基单独作用具有支持造血的能力，促进造血干/祖细胞向髓系血细胞分化，而不向红系和淋巴细胞分化。经过体外标准体系长期传代培养后，人脐带间充质干细胞生物学特性存在一定差异，其增殖能力下降；随着长期传代次数的增加，人脐带间充质干细胞多种造血相关细胞因子表达上调，使得条件培养基造血支持能力显著增强。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329

【参考文献】

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1 王丁;CD14~+单核细胞增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用[D];中国协和医科大学;2010年

本文编号：1224245