小鼠胚胎干细胞条件培养基促进人脂肪干细胞增殖

发布时间：2017-11-26 19:31

  本文关键词：小鼠胚胎干细胞条件培养基促进人脂肪干细胞增殖

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【摘要】：目的： 用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，，mES）条件培养液（conditionmedium，CM）培养人脂肪干细胞（human adipose derived stem cells，hADSC），检测hADSC的增殖速率，试图找到一种能够促进hADSC快速增殖并不影响细胞性质的方法。 方法： hADSC提取培养及鉴定——hADSC分离传代培养；MTT法检测hADSC的增殖活性；hADSC的细胞表面标记和细胞周期的流式细胞仪的检测；成骨成脂分化能力分别用茜素红和油红O染色进行鉴定。 mES未分化状态的鉴定以及条件培养基的制备——mES培养液中添加LIF（leukemia inhibitory factor）培养在饲养层上传代，抑制细胞分化；mES的RNA提取后用PCR鉴定其多能性因子的表达情况；收集培养了未分化状态的mES24h后的培养液，过滤后即为CM培养液（condition medium）。 CM培养液培养hADSC，检测生化分子指标——将hADSC分为三组，分别用hADSC培养液、40%CM培养液和40%ES培养液来进行培养，分为ADSC组，CM组，ES组。流式细胞仪检测三组细胞表面标记，PCR检测hADSC的细胞特异性表达基因c-kit和sca-1的表达用来鉴定细胞性质变化；用MTT检测三组细胞增殖速率，三组细胞计数制备生长曲线，通过流式细胞仪检测细胞周期；Q-PCR检测三组细胞多能性因子nanog，OCT-4的表达量；用PCR检测细胞凋亡标志基因caspase-3s，Q-PCR检测caspase-3的表达，流式细胞仪检测P3、P15代的hADSC的凋亡；用Q-PCR检测hADSC成骨分化0d、7d、14d的ALP，collagen type I，OPN，RUNX-2的标志基因的表达量的检测，细胞在诱导21d时进行茜素红的染色；hADSC成脂诱导分化14d后进行油红O染色。 结果： 1.MTT结果显示，hADSC增殖曲线呈S形，增殖情况良好；流式细胞仪检测表面因子表明CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表面标记阳性表达，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR表面标记因子阴性表达；流式细胞仪检测hADSC细胞周期表明（87.3±0.48）%的细胞处于G1期、（5.3±0.84）%的细胞处于G2期以及（7.4±0.35）%的细胞处于S期；茜素红S染色，油红O染色结果显示hADSC具有向成骨和成脂分化的能力，符合间充质干细胞的基本性质。 2.mES的细胞集落呈圆形突起状生长，球形饱满，克隆的边缘光滑且细胞核质比高，有较好的折光率。其多能性基因nanog、OCT-4、sox-2高表达。收集该细胞状态下的ES细胞培养24h后的培养液，0.22um的滤器过滤除去其中可能混有的胚胎干细胞。 3.流式细胞仪检测三组表面标记结果显示，经CM培养后的ADSC，其阳性表达细胞表面标志CD29，CD44，CD73，CD90，CD105表达量无变化，阴性表达的表面标志CD31，CD45表达量降低，HLA-DR表达量增加；PCR结果显示c-kit与Sca-1的表达量均表达，无差异；MTT法检测细胞增殖速率，40%CM组MTT吸光值显著高于ADSC组（P=0.0120.05），细胞计数的结果显示CM组的细胞增长速率显著高于其他两组，流式细胞仪检测细胞周期，显示CM组处于S期的百分数高于其他两组，间接显示CM组细胞增殖速度快；Q-PCR结果显示，OCT-4表达量，CM组，ES组表达量显著高于ADSC组，nanog的表达，CM的表达量显著高于ES组，ADSC组，结果表明CM培养液能够增加hADSC的多能性；PCR结果显示Caspase-3的表达量CM组显著低于ADSC组，P=0.0030.01差异极显著，流式细胞仪检测细胞凋亡，显示CM组的细胞凋亡比率低于ADSC实验组，说明CM培养液能够抑制hADSC凋亡；ALP及COL I的表达量，诱导七天时表达量最高，ALP：7d的表达量与0d、14d有显著性差异，0d、7d、14d组间无差异。COL I：ADSC组CM组，7d与0d、14d有显著性差异，组间无差异。OPN与RUNX-2是成骨分化晚期表达的基因，诱导14d的ADSC组和ES组OPN及RUNX-2的表达量显著高于CM组。 结论： 1.胚胎干细胞条件培养液（ESC-CM）能够显著的提高hADSC的增殖速率。并不影响hADSC的细胞性质。 2.胚胎干细胞条件培养液（ESC-CM）能够增加nanog，OCT-4的基因的表达量，增加了hADSC的多能性，并且能够抑制hADSC的凋亡。 3.在成骨成脂诱导分化中，成骨早期表达的基因组间没有明显的差异，但是晚期表达的基因如OPN，RUNX-2表达量，CM组明显低于其他两组。但诱导28d的hADSC经过茜素红S染色后，钙结节数目无明显的差异，说明CM培养液增加了hADSC的原始性。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329

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本文编号：1230920