衰老过程中小鼠海马神经发生及微环境改变的初步研究

发布时间：2017-11-27 09:09

  本文关键词：衰老过程中小鼠海马神经发生及微环境改变的初步研究

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【摘要】：目的 成年哺乳动物的脑内保留着一群具有自我更新能力和多方向分化潜能的细胞群，被称之为神经干细胞（NSCs）。神经干细胞经历不对称分裂成为定向祖细胞，并逐渐向功能区域迁移、发生可塑性变化并与其他神经元建立突触联系，最终具有神经元功能，这个过程是神经发生。神经发生对维持大脑功能和结构有着重要的作用。在哺乳动物的神经系统中存在两个主要的神经发生区域：海马齿状回颗粒下层和侧脑室下区。海马齿状回的神经发生与高级功能，如学习、认知、记忆等密切相关。有文献报道成年海马神经干细胞通常处在静止状态，在整个寿命中会重复几次离开G0期，进行不对称分裂并在特定的微环境下调控下向神经元、少突胶质细胞或星型胶质细胞分化，然后再进入静止期。在衰老期，海马的新生神经元产生减少，这与记忆、认知功能下降密切相关。关于衰老期海马神经发生减少的原因，目前研究人员的意见并不统一，归纳起来有四种猜测：1.海马DG神经干细胞大量凋亡；2.神经干细胞数量不变，但处于静止期的神经干细胞比例上升，3.神经干细胞数量不改变，但向胶质细胞方向分化的比例升高；4.神经干细胞分化形成新生的神经元迅速大量凋亡。 衰老过程中神经发生减少已经成为共识，但衰老期海马神经发生的具体哪个阶段停滞或异常导致新生神经元减少，与海马中哪些因素的改变相关等问题还有待深入研究。本研究拟通过测定青年、中年、老年三个年龄段小鼠海马齿状回SGZ细胞的增殖能力、向神经元方向分化的能力、神经干细胞本身的数量改变、新生成神经元的数量几方面探讨衰老进程中小鼠海马神经发生的改变；通过对金属基质蛋白酶9的表达、神经营养因子含量的改变和海马过氧化损伤及抗氧化能力观察不同年龄阶段海马微环境的改变；并进一步检测海马中衰老相关基因的表达。研究的目的是了解衰老小鼠中海马神经发生及其内环境的改变，为促进海马神经发生、延缓衰老，改善学习、认知、记忆能力，提供可能途径和实验依据。 方法 1. C57BL/6J雄性小鼠27只，分为青年A组9只（2-3月龄），中年B组9只（6-8月龄），老年C组9只（18-20月龄）。 2.麻醉灌注后断头取脑，石蜡包埋，作海马区冠状连续切片，随机选取一个半脑，OCT包埋,海马区冠状连续冰冻切片，每只鼠选取三张非连续切片（按解剖标志保证组间位于相同平面），免疫组化（SP法）检测并计数海马SGZ区nestin+(神经干细胞的标志)、DCX+（成神经细胞）、PCNA+（增殖活跃）的细胞个数。 3.断头取脑，矢状分成左右两部分，随机选取一个半脑，OCT包埋,海马区冠状连续冰冻切片，每只鼠选取三张非连续切片（按解剖标志保证组间位于同一平面），MMP-9（金属基质蛋白酶9，基质退化程度指标）免疫荧光染色，β-半乳糖苷酶（衰老程度指标）染色。 4.麻醉后断头取脑，分离海马，匀浆，离心收集上清，比色法测GSH含量和GSH-PX活性（抗氧化能力指标），硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA，氧化损伤程度指标)含量。 5.麻醉后断头取脑、分离海马、匀浆，离心收集上清、ELISA检测各年龄组小鼠海马神经营养因子BDNF、GDNF的改变。 6.断头取脑，分离海马，提取海马组织总RNA,RT-PCR检测各年龄组小鼠海马衰老相关基因p19Arf、p21Cip1/Waf1mRNA表达的改变。 结果 1.海马神经发生指标显示： 1）海马SGZ NSCs(nestin+细胞)数分别在青年A组为(61.33±23.02)，中年B组(35±11.53)，老年C组(19.33±8.33)；NSCs数量随着年龄增长减少。 2）海马SGZ增殖活跃期的细胞数（PCNA+细胞）数分别在青年A组为(56.67±9.29)，中年B组(19±6.24)，老年C组（4.33±2.08）；SGZ增殖活跃细胞数量随着年龄增长减少。 3）海马SGZ成神经细胞（NBs，DCX+细胞)数分别在青年A组为(82.33±8.50),中年B组(30±3)，老年C组(12.33±1.52)；SGZ NBs数量随着年龄增长减少。 2.海马神经发生微环境指标显示： 1）抗氧化能力指标与氧化损伤程度：各年龄组海马组织谷胱甘肽（GSH）的含量分别是青年A组(9.77±3.125)mg/gprot，中年B组(4.94±1.59)mg/gprot，老年组(3.94±1.11)mg/gprot；GSH-PX的活性分别是：青年A组（124.09±23.34)活力单位，中年B组（106.48±14.24）活力单位，老年C组(60.621±14.71)活力单位；随着年龄增长海马组织中GSH含量下降、GSH-PX活性减弱。MDA含量分别为青年A组(8.3±0.8)nmol/mg，中年B组(9.7±1.57)nmol/mg,老年C组(12.8±1.9)nmol/mg；脂质氧化物（MDA）含量增加。 2）β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色：各组海马CA区β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性强度随年龄增加逐渐增高，β-半乳糖苷酶染色阳性区域集中在CA区，DG区未见表达。 3）各年龄小鼠海马组织中神经营养因子的水平: BDNF含量在青年A组为(107.42±18.55)pg/ml，中年B组为(89.04±15.7) pg/ml，老年组C为(58.45±15.29) pg/ml；GDNF含量在青年A组为(384.56±59.12)pg/ml；中年B组为(297.59±14.69) pg/ml；老年C组为(203.33±34.83)pg/ml。 4）海马组织金属基质蛋白酶MMP-9表达，在衰老期明显增高，主要集中在CA区，DG区未见表达。 3.衰老小鼠海马衰老相关基因p19Arf、p21Cip1/Waf1mRNA表达增高。 结论 1．自然衰老小鼠海马SGZ处于增殖活跃期细胞数、神经干细胞的数量和成神经细胞数量，与青年期相比都明显减少，提示自然衰老的小鼠海马SGZ神经发生减少。 2.自然衰老小鼠海马组织抗氧化能力的下降、氧化损伤程度增强，神经营养因子水平下降，金属基质蛋白酶MMP-9表达增加，可能与海马SGZ神经发生减少相关。 3.自然衰老小鼠海马组织，，衰老相关基因p19Arf、p21Cip1/Waf1mRNA表达增高，提示p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信号通路可能与海马神经发生的下降相关。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R339.38

【参考文献】

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本文编号：1231312