mTOR在TLR信号通路中对前炎症细胞因子表达的调控机制研究
本文关键词：mTOR在TLR信号通路中对前炎症细胞因子表达的调控机制研究
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【摘要】：目的：研究mTOR激酶在小鼠原代细胞TLR信号通路中对相关前炎症细胞因子的表达调控，寻找其调控的关键转录因子，探索其分子调节机制。为进一步研究TLR信号通路的调控及mTOR相关疾病的治疗提供靶点。 方法：分离纯化小鼠DC，pMΦ和BMDM。用雷帕霉素预处理小鼠DC30min阻断mTOR激酶后，用LPS激活DC TLR信号通路，不同时间点提取细胞总RNA，通过qPCR检测多种前炎症细胞因子mRNA水平进行初筛，寻找mTOR调节的靶基因；根据筛选结果用qPCR在小鼠原代细胞pMΦ与BMDM中进一步检测IL-10、IL-12、IL-23、CXCL1和TNFα；采用LPS和R848分别对pMΦ进行单刺激和共刺激处理，ELISA法检测mTOR调节的前炎症细胞因子IL-10、IL-12和IL-23的蛋白表达水平；雷帕霉素预处理pMΦ约30min后,用LPS进行诱导,分别于1h、2h、4h、8h提取细胞总蛋白，采用western bolt检测mTOR对TLR4信号通路中MAPKs家族（ERK1/2、JNK1/2/3、p38）、IKKα/β、IκBα激酶及IRF3转录因子的激活情况。阻断mTOR后分离细胞核蛋白，用western bolt检测mTOR调节的靶转录因子，进一步在总蛋白水平检测mTOR调节的S6K1和4E-BP1激酶的磷酸化水平；构建pLKO.1-cMaf和pLKO.1-stat3慢病毒载体和包装慢病毒，分别沉默BMDM中的目标转录因子，检测mTOR对前炎症细胞因子IL-10、IL-12和IL-23的表达的影响。 结果：用雷帕霉素阻断mTOR激酶后，检测了TLR4信号通路中IL-10、IL-12、IL-23、CXCL1和TNFα等多种分子的表达情况，结果显示mTOR能够特异性促进IL-10及抑制IL-12和IL-23的表达。LPS和R848单独和组合刺激时，mTOR对细胞因子的调节作用均为共刺激组强于单刺激组，且mTOR的调节作用与雷帕霉素呈剂量依赖性关系。蛋白水平检测结果发现：在pMΦ中激活的TLR4信号通路中，mTOR不参与调节MAPKs家族激酶（ERK、JNK和p38）的激活，及其NF-κB上游激酶IKKα/β、IκBα信号的激活。检测IRF3信号，发现mTOR也不影响IRF3的激活及下游IFN-β和CXCL10的表达。提取并检测细胞核蛋白发现：mTOR能特异性影响转录因子cMaf和stat3，而不影响ATF2、β-catenin等其它多种核转录因子的入核。进一步检测细胞总蛋白中cMaf和stat3的表达，结果显示抑制mTOR后能够显著降低cMaf总蛋白的合成及显著抑制stat3的磷酸化，而不影响stat3总蛋白的合成。在BMDM中沉默转录因子cMaf，，检测LPS和R848组合刺激的TLRs信号通路中细胞因子的表达水平，发现IL-12p40和IL-12p70的表达显著升高，IL-10的表达显著下降，而IL-23p19的表达不受影响。沉默转录因子stat3，检测相应细胞因子的的表达水平，结果显示IL-10、IL-12p40、IL-12p70和IL-23p19的表达水平均升高。 结论： 1.在TLR4、TLR7/8信号通路中mTOR能够促进IL-10和抑制IL-12、IL-23前炎症细胞因子的表达。 2.在TLR4信号通路中mTOR不参与调节MAPKs激酶家族（ERK、JNK、p38）和IKK激酶的信号激活。 3.在TLR4、TLR7/8信号通路中mTOR通过促进转录因子cMaf的翻译增强IL-10及抑制IL-12的表达，通过促进stat3磷酸化抑制IL-10、IL-12和IL-23的表达。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
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