G6PD在AngⅡ诱导的HUVEC氧化应激中的作用

发布时间：2017-12-02 12:20

  本文关键词：G6PD在AngⅡ诱导的HUVEC氧化应激中的作用

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【摘要】：目的：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD），是哺乳动物中一个重要的看家酶；在磷酸戊糖途径中为首个限速酶，广泛分布于全身各组织细胞内。G6PD是机体正常的新陈代谢和生长发育过程中必不可少的一种酶；对维持胞浆池的NADPH和细胞的氧化还原平衡是不可缺少的。G6PD基因突变会造成G6PD蛋白部分功能的缺失，可导致新生儿黄疸，药物或感染介导的溶血危象，蚕豆病等。最近的研究显示G6PD在细胞和生物体的生理机能等方面具有重要作用。G6PD活性缺失，会干扰氧化还原的平衡状态，可导致细胞生长失调和信号传导异常，还会出现胚胎发育异常，增加退化性疾病的易感性等。但到目前为止，细胞处于氧化应激状态时，G6PD的活性变化以及与磷酸戊糖途径的关系尚不清楚，因此，研究G6PD的活性变化对了解如何维持细胞内NADPH和细胞的氧化还原平衡状态以及相关疾病的发病机制都具有十分重要的意义。 人类的G6PD基因是一个X连锁遗传基因，位于Xq28区域，包含有13个外显子和12个内含子，长约有21kb。第一个外显子没有编码序列，位于第2和3外显子中间的内含子长约9kb。 血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是由血管紧张素Ⅰ转化生成的多肽（八肽）物质；是肾素－血管紧张素系统RAS中最为重要的活性物质。RAS在维持机体血压稳定及调节水、电解质平衡中发挥了重要作用。RAS活性的变化与心血管疾病的发生、发展具有密切相关性。在动脉硬化的发生、发展过程中，AngⅡ通过多种效应参与。AngⅡ刺激导致血管产生过量的自由基，进一步导致血管内皮细胞损伤，发生炎症反应和功能障碍，成为动脉粥样硬化的基础。但是血管内皮细胞在处于氧化应激状态时，细胞内会出现什么样的变化？G6PD活性会有怎样变化以及与磷酸戊糖途径又有什么关系，尚不清楚。 基于上述情况，本实验选用人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）作为研究对象，使用AngⅡ刺激细胞复制氧化应激的模型，观察细胞内一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）、NADP/NADPH及G6PD蛋白的变化。对AngⅡ致HUVEC的氧化应激时，G6PD的变化以及与磷酸戊糖途径的关系进行研究。 方法： 1细胞培养 人脐静脉内皮细胞株用含有100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10%FBS的低糖DMEM培养基，置37℃，5%CO2及饱和湿度下培养24小时，换用无血清的DMEM培养基再培养24小时。然后换用含有刺激因素和10%胎牛血清的DMEM培养基培养至所需时间后，收集细胞或上清液用于以下实验。 2活性氧（ROS）的检测 (1)分别给予细胞0，10-6，10-7，10-8mmol/L AngⅡ刺激，作用相同的时间1h后，采用活性氧检测试剂盒对不同浓度产生的活性氧进行检测。 (2)用相同浓度10-6mmol/L的AngⅡ，分别给予细胞0h，0.5h，1h， 3h的刺激后，采用活性氧检测试剂盒对不同时间产生的活性氧进行检测。3NADP/NADPH的变化检测 给予细胞相同浓度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分别作用0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取细胞，按试剂盒说明书熔炼细胞2次，进行测定。 4G6PD活性变化测定 给予细胞相同浓度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分别作用0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取细胞，裂解蛋白并定量，冻于-70℃。按试剂盒说明书进行测定。 5G6PD蛋白表达变化检测 给予细胞相同浓度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分别作用0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取细胞，提取蛋白，Western Blotting对G6PD进行测定。 6NOS及NO的检测 (1)分别给予细胞0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min用相同浓度10-6mmol/L的AngⅡ的刺激后，收取细胞上清液，采用NO试剂盒进行检测。 (2)分别给予细胞0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min用相同浓度10-6mmol/L的AngⅡ的刺激后，收取细胞上清液，采用NOS试剂盒进行检测。 7数据处理 所有数据均用X S表示，采用SPSS16.0软件进行处理，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，多样本均数比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA），以P 0.05为差异有统计学意义。 结果： 1AngⅡ刺激HUVEC后ROS的产生增多。 (1)不同浓度的AngⅡ(0，10-6，10-7，10-8mmol/L)刺激细胞1h后，荧光显微镜下观察，以10-6mmol/L时荧光强度最强。 (2)用10-6mmol/L AngⅡ刺激细胞0h，0.5h，1h，3h，，6h后，荧光显微镜下观察，以1h时荧光强度最强。 2HUVEC氧化应激发生发展过程中NADP/NADPH（Ratio）逐步下降。 用10-6mmol/L AngⅡ分别给予细胞0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min刺激后： 随着时间的延长，NADP/NADPH（Ratio）5min明显增加后，逐步下降，于1时达到最低。 NADP/NADPH的变化提示在氧化应激发生、发展过程中，磷酸戊糖途径的代谢活性短暂受到抑制后，逐步增强。 3内皮细胞氧化应激的发生、发展过程中G6PD的活性及含量的变化。 HUVEC给予10-6mmol/L AngⅡ刺激后，分别于0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min检测。结果表明，G6PD的活性随时间的延长，呈现先下降后上升的变化规律，说明氧化应激初始期G6PD活性受到抑制，随着时间的延长，其活性逐渐恢复。而G6PD蛋白表达的变化与G6PD活性的改变呈平行关系。 4AngⅡ刺激HUVEC后可使NO的含量、NOS的活性下降。 用相同浓度10-6mmol/L的AngⅡ分别给予细胞0min，5min，15min，30min，60min，90min，120min刺激。 A细胞中NO表达水平在5min时升高，之后随着时间的延长呈下降性趋势，并于1时达到最低峰。 B细胞中NOS活性同样在5min时出现升高，之后随着时间的延长呈下降性趋势。 细胞内NO含量的降低及NOS活性的下降，说明内皮细胞的功能受损。 结论： 110-6mmol/L AngⅡ孵育HUVEC1h是体外建立内皮细胞氧化应激模型的最佳条件。 2氧化应激通过改变G6PD的活性干扰磷酸戊糖途径及代谢稳态，促发内皮功能障碍。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411

【共引文献】

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4 李晶晶;温冬梅;张秀明;;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定方法及其与糖尿病和糖化血红蛋白关系的研究进展[J];国际检验医学杂志;2014年18期

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本文编号：1244904