MurA蛋白的表达及其多抗用于免疫磁珠富集单增李斯特菌的快速检测

发布时间：2017-12-03 11:24

  本文关键词：MurA蛋白的表达及其多抗用于免疫磁珠富集单增李斯特菌的快速检测

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【摘要】：目的：单增李斯特菌表面蛋白MurA可作为检查的标志分子，原核表达MurA，制备鼠多克隆抗体，将抗体与磁珠偶联制成单增李斯特菌免疫磁珠，将免疫磁珠富集技术结合选择性平板培养法，建立免疫磁珠-选择性平板快速检测技术，以缩短增菌耗时和提高特异性。 方法：设计MurA蛋白的基因引物，PCR扩增后，将MurA基因插入原核表达载体pET28a(+)中，转化大肠杆菌进行优化表达；表达产物经镍柱纯化，质谱分析后免疫小鼠，制备抗MurA的多克隆抗体；通过间接ELISA方法，分析多抗效价及交叉性；用多抗制备MurA特异性免疫磁珠，建立单增李斯特菌免疫磁珠-选择性培养基检测方法，并对人造污染牛奶样品进行检测。 结果：上清中见72kD的可溶性诱导蛋白表达，经质谱鉴定其为MurA蛋白；3次免疫小鼠后，MurA抗血清效价达1:10000，，与伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、大肠杆菌及属内其它病原菌均无交叉反应，显示了良好的特异性；用该抗血清制备的免疫磁珠结合选择性培养基检测法。单增李斯特菌浓度≥103CFU/mL均能检出，与英诺克李斯特菌存在轻微交叉反应；仅需9h增菌可检出牛奶样品，较传统方法可将增菌时间缩短39h，减少3/4以上的耗时；检测限为0.4CFU/mL。 结论：成功表达并经镍柱纯化得到高纯度的单增李斯特菌MurA蛋白，制备的鼠源抗MurA多克隆抗体亲和力高，特异性好；将制备的免疫磁珠结合选择性培养基法快速检测方法，24h内完成对牛奶样品的检测，较国标法减少42h（3/4）以上。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：1248550