转染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列的BHK-21细胞沉默病毒复制研究

发布时间：2017-12-04 10:23

  本文关键词：转染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列的BHK-21细胞沉默病毒复制研究

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【摘要】：登革病毒(dengue rivus, DENV)属于黄病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavi virus),由其感染所引起的疾病包括：登革热(dengue fever, DF),登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合症(dengue shock syndrome, DSS)。严重的登革出血热(登革出血热和登革休克综合症),20世纪50年代在菲律宾和泰国登革热流行期间被首次确认。截止至2012年11月WHO报告,近几十年来,世界各地的登革热发病率大幅增长。世界上二分之一的人口,非洲,美洲,东地中海,东南亚和西太平洋地区超过100个国家处于登革热流行的威胁中,2008年,美洲、东南亚和西太平洋地区的国家登革热病毒感染报告病例数120万,而到2010年,报告病例数上升至230万,最近报告病例仍在持续增加[2]。登革热不仅发病率和病死率呈上升趋势,而且暴发疫情的地区也呈扩大化的趋势,以前从未发现过登革热疫情的国家遭受登革病毒的威胁。登革热在2012年被WHO列为传播速度最快的媒介传播病毒性疾病,它具有在世界上出现流行的可能性。全世界需要改变应对方式,并实施可持续性预防措施。登革热成为全球关注的热点。 目前控制登革热的方法主要是用化学方法控制传播媒介,这种方法对登革病毒的预防和控制发挥了举足轻重的作用。然而,随着杀虫剂等化学制剂的广泛应用,这种方法亦产生许多的负面影响：蚊虫产生抗药基因,破坏环境—化学制剂残留于环境中。同时,由于热带和亚热带地区城市化进程加快以及国际间交流的增加导致白纹伊蚊活动范围扩大[5-7],登革病毒的疫区产生扩大化趋势。因而,有学者指出,应对登革病毒传播需要有效的新策略。如加紧致力于新型有效疫苗的研发,通过基因修饰或操纵传播媒介等。通过基因修饰传播媒介,改变病毒感染的宿主易感性,从而达到媒介中病毒复制的降低或消除,这种方法称为源于病原体的抵抗(pathogen-derived resistance, DPR)[8-9]。 DPR最早在植物中发现,合成的烟草花叶病毒外壳蛋白在转基因植物中的表达有效地保护了植物来自同源病毒的攻击。这种现象后来被命名为RNA干扰效应。RNA干扰是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象,RNAi被发现广泛存在于生物界,从低等原核生物、真菌、无脊椎动物、哺乳动物中也发现了此种现象。RNAi抗病毒的效应已在多种媒介昆虫中发现,Ronald P. van Rij[10]等发现,黑腹果蝇中RNAi途径中关键酶Ago-2缺陷株体内病毒RNA呈高水平累积；Vargas[11]等通过敲除RNAi途径中的AGO-2、Dcr-2和R2D2的表达后,能增加登革Ⅱ型病毒在埃及伊蚊体内的复制。有研究者已开始利用RNAi干扰的技术修饰或改造媒介,使得媒介减少携带或者不携带病毒。Anthony KG等通过引入dsRNA已成功用于抑制西尼罗河病毒(WNV)、日本脑炎病毒(JEV)和黄热病毒(YFV)的复制；Franz AW等经短片段RNA (short interfering RNA, siRNA)改造的转基因蚊有效地阻止病毒的感染和传播；Zhang等通过腺病毒载体转染短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)至哺乳动物细胞内,对DENV-2复制产生干扰效应,抑制病毒的复制。RNAi有望成防控登革病毒感染的新策略。 登革病毒的基因组为单股正链RNA分子,约含11000个碱基,具有单一的可读框,编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白,其编码基因顺序为：5'-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3'。其中prM蛋白的切割被认为是未成熟病毒颗粒向成熟病毒颗粒转变的关键步骤,与病毒的装配、成熟和维持病毒的感染性有关。因而,prM被许多研究者选为触发RNAi的效应基因。成功介导RNAi还需稳定高效的表达系统。质粒作为载体导入效应基因有以下优点：可以使用不同的选择性标志；通过构建可诱导的表达系统,可长期稳定进行基因表达；进行大规模基因筛选的成本低。本研究利用能在多种哺乳动物细胞中高效表达的真核表达载pcDNA3.1(+),把登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重复序列克隆到该表达载体,瞬时转染至登革病毒易感性高的BHK-21中初步探讨干扰病毒复制的效果,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评价其抑制病毒复制的效果,为防控登革病毒感染的新策略提供一定的理论基础。 目的： 1.构建RNAi表达载体：将登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重复序列克隆至能在多种哺乳动物细胞中高效表达的真核表达载体pcDNA3.1(＋)中。 2.构建重组质粒pcDNA-eGFP,转染BHK-21细胞,测定转染效率。 3.转染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列至BHK-21细胞,半定量PCR和实时荧光定量PCR评价重组质粒抑制病毒复制的效果。 方法： 1.乳鼠内接种登革Ⅱ型病毒,提取病毒total RNA。 2.正义和反义引物两端分别加上Xho I和EcoR I的识别位点,以提取的totalRNA为模板,经RT-PCR扩增的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM。 3.于另一对正义和反义引物两端引入酶切位点NheⅠ和BglⅡ,经RT-PCR扩增prM全长基因片段插入pMD18-T-vector中,形成含有正向序列的重组质粒pMD18-T-prM。 4.限制性内切酶NheⅠ和Kpn I分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。 5.扩增增强型荧光蛋白基因片段(eGFP),克隆至pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA-eGFP。 6.重组质粒pcDNA-eGFP转染BHK-21细胞,观察转染效率。 7.BHK-21细胞繁殖登革Ⅱ型病毒,收集病毒液。 8.免疫荧光检测登革病毒感染BHK-21细胞。 9. TCID50方法测定收集的病毒液滴度。 10.筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA和空质粒pcDNA3.1(+)用脂质体法转染至BHK-21细胞中。 11.登革Ⅱ型病毒攻击细胞,染毒后不同时间收集细胞total RNA。 12.半定量PCR检测NS3基因的表达,以评估病毒复制水平。 13.实时荧光定量PCR检测细胞内病毒载量,评估细胞内病毒复制水平。 14.实时荧光定量PCR检测NS1基因表达,评估病毒复制水平。 结果： 1.收集接种登革Ⅱ型病毒乳鼠鼠脑病毒液并提取病毒RNA。 2. RT-PCR反应扩增前膜蛋白全长基因,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见单一条带,扩增效果较好,其大小约600bp,与理论值基本相符,测序结果提交至NCBI进行比对,同源性达97%。 3.构建的重组载体pMD18-T-prM, pcDNA-asprM和含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA,经限制性内切酶进行酶切均可见特异的酶切条带。 4.成功扩增增强型荧光蛋白基因eGFP序列,经测序证实重组质粒pcDNA-eGFP中的eGFP cDNA序列与质粒pEGFP-N质粒(Gene blank accession:#U55762)中的EGFP cDNA序列一致,成功构建了重组质粒pcDNA-eGFP。 5.成功在本室建立登革Ⅱ型病毒感染BHK-21细胞模型,收集病毒液经TCID50测得的滴度为106.48TCID50/0.1ml。 6.重组质粒pcDNA-eGFP转染BHK-21后,在细胞内有增强型荧光蛋白表达,并初步测定转染率：在24h、48h、72h和96h转染率分别为36.3%、45.0%、31.6%和31.3%。 7.在不同时间点收集经DENV-2攻击的实验组、空白对照组和阳性对照组细胞中的RNA,半定量PCR检测NS3mRNA的表达。扩增的NS3基因电泳带存在明显差异。Glyko BandScan分析NS3和内参GAPDH灰度的比值,结果显示,48hpi和60hpi,实验组、空白对照组和阳性对照组的NS3mRNA表达量基本相同,在96hpi,实验组和阳性对照组间mRNA表达量存在差异,实验对照组的NS3表达水平比阳性对照组降低28%。 8.建立荧光定量PCR检测DENV2的方法：扩增NS1基因和内参GAPDH,阳性扩增曲线整体平行性好,基线平坦,曲线光滑,拐点清楚,呈S形,重复性好；收集的溶解曲线峰型单一,只有一个主峰。表明所采用的反应体系和引物的扩增效率、特异性和模板的量都是合适的；利用登革Ⅱ型病毒的非结构蛋白NS1基因,构建了检测登革Ⅱ型病毒的标准品,在标准曲线的基础上,可以检测出待测标本中病毒的拷贝数。 9.在不同时间点收集经DENV-2攻击的实验组和阳性对照组BHK-21细胞中的RNA,应用FQ-PCR检测细胞内病毒载量的变化。结果显示,在48hpi内,实验组和对照组细胞内病毒载量变化不大,在72hpi,两组细胞内病毒载量达到峰值,但实验组病毒量与对照组相比,病毒拷贝数少1.44倍。在96hpi,实验组病毒载量比阳性对照组病毒载量降低26.7%。 10.在不同时间点收集经DENV-2攻击的实验组和阳性对照组BHK-21细胞中的RNA,应用FQ-PCR检测细胞内NS1表达水平的差异。归一化值结果显示病毒感染96h后,实验组中NS1表达量与阳性对照组比较显著降低(P0.05),其余两个时间点(48h、60h)NS1表达量的组间差异无统计学意义(P0.05)。 结论： 成功克隆登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重复序列的重组质粒；登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的效果；为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.33

【参考文献】

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1 徐丽华;刘春雷;常玉梅;梁利群;刘金亮;高国强;韩启霞;;双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法[J];生物技术通报;2011年01期

2 葛春喜,黄炯烈,陈观今,吴瑜,于洪枫;登革病毒在白纹伊蚊细胞内免疫的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2003年08期

3 蔡燕丽;郑学礼;;白纹伊蚊AGO2和Dcr-2基因片段克隆及各发育期转录水平分析[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2012年03期

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本文编号：1250684