姜黄素经mTOR信号通路增强骨髓间充质干细胞的抗氧化应激作用
发布时间：2017-12-04 19:01
本文关键词：姜黄素经mTOR信号通路增强骨髓间充质干细胞的抗氧化应激作用
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【摘要】：骨髓间充质干细胞（BMSC）因其强大的增殖能力和较强的多向分化潜能，而且不涉及到伦理学问题，又具有取材方便、便于自体移植、外源性基因转染等优点，是组织工程的理想种子细胞，因此越来越受到人们关注。BMSC现在已被用于一些临床疾病的细胞移植治疗，比如骨发育不全、急慢性移植物抗宿主反应疾病、炎性肠病、缺血性心脏病、未愈合性溃疡、缺血性发作以及帕金森病等。尽管细胞治疗为许多临床疾病的治疗带来了新希望，提供了一种新的治疗手段，然而，临床研究发现移植入缺血区MSC的存活率非常低，移植24h后，大约99%的BMSC发生凋亡［1］。因此，干细胞存活率低下成为了细胞移植技术发展的关键障碍。 损伤局部的缺血缺氧微环境和炎症环境（中性粒细胞和巨噬细胞是ROS最主要的来源）均能引起活性氧复合物(reactive oxgenspecieces，ROS)的释放，体内活性氧的大量堆积可以促使细胞凋亡、坏死和组织损伤。体内ROS主要包括:超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢(H2O2)等，通过激活许多信号传导通路来导致细胞损伤。为此，增强干细胞的抗氧化损伤能力是解决移植BMSC存活率低的关键问题。 在氧化应激的多条通路中，mTOR（雷帕霉素靶蛋白）通路发挥着重要的作用，mTOR通路是介导细胞生长和阻止细胞死亡的重要的信号转导通路,同时参与细胞凋亡的调控[2]，研究显示mTOR信号的小分子抑制剂可以通过降低Mcl-1的表达和增加磷酸化的Bim的表达来促进凋亡。由于Bim可以直接刺激Bax和Bak的活化，并且间接的与抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1结合，Bim表达水平的上调抑制了mTOR信号通路的活化，最终导致促/抗凋亡蛋白失衡，从而发生凋亡[3]。 姜黄素作为食物香料的主要成分被人们所熟知，它是一种从中药姜黄中提取的天然产物石榴籽多酚，由于其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗淀粉样变性等广泛的药理作用而被临床运用于治疗多种慢性疾病，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森疾病、多发性硬化，癫痫、脑损伤、脑损伤、糖尿病和艾滋病等，，并取得一定的疗效。目前公认的姜黄素作用机理主要有：①抗氧化作用：氧化损伤是BMSCs移植治疗时所遭遇最主要的有害刺激之一。姜黄素是一种天然的抗氧化剂，其含有的酚性羟基可以直接捕获或清除自由基，其清除自由基能力甚至高于维生素②抗炎症反应：炎症反应也是造成干细胞移植损伤的原因之一。体外实验表明，姜黄素能够清除自由基，并使细胞免于脂类及蛋白质过氧化反应造成的损害。但是BMSCs在氧化损伤的环境下，姜黄素能否通过mTOR通路来发挥抗氧化应激作用未见相关报道。 为此，本实验通过H2O2建立BMSCs的氧化应激模型，观察BMSCs在不同浓度的H2O2刺激下的形态学和病理学变化，采用MTT检测不同浓度H2O2对BMSCs增殖的影响。用Western blot等检测方法，探讨BMSCs在氧化应激中mTOR信号通路和凋亡蛋白的表达变化，以及姜黄素干预后中，通过调节mTOR信号通路和凋亡蛋白的变化来减轻氧化应激性刺激对BMSCs的损伤的机制。最终为细胞的抗氧化治疗提供新的实验依据和思路。 第一部分：mTOR信号通路及凋亡相关蛋白在BMSCs氧化应激中的作用方法 1. BMSCs分离、培养与鉴定 2. BMSCs氧化应激模型的建立：实验分组：对照组（BMSCs常规培养）和氧化应激损伤组（BMSCs常规培养+100、200、300、400、500、800、1000μmol/L H2O2）损伤组（n=5） 3.氧化应激性刺激对BMSCs的损伤 倒置相差显微镜观察对照组和损伤组H2O2处理24h后的BMSCs的形态学改变。 MTT法检测在对照组和损伤组H2O2处理24h、48h、72h小时后，H2O2对BMSCs的增殖抑制作用。 荧光显微镜观察H2O2处理BMSCs24h后的hochest33342染色核的凋亡形态学改变。 4. western blot检测H2O2处理BMSCs后mTOR、p70s6k、s6蛋白以及蛋白磷酸化的表达。 5. western blot检测H2O2处理BMSCs后的Bax、Bcl-2蛋白表达水平。 6.实验所有数据用SPSS17.0进行统计分析，组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD检验。 结果 1.100～1000μmol/L浓度的H2O2处理mBMSCs24h后，其形态学发生病理学的浓度依赖性改变。 2. MTT检测结果显示：随着H2O2的浓度及作用时间的增加，BMSCs的死亡数量相应增加。 3. hochest33342染色显示：随着H2O2浓度的增加，细胞核的凋亡形态增多，与对照组相染色结果比，H2O2浓度在500～1000μmol/L时，凋亡细胞数量显著增多。 4. H2O2浓度在100～300μmol/L时，随着H2O2浓度的递增，mBMSCs的mTOR、P70S6K、S6蛋白的表达有增高的趋势，其磷酸化表达也明显增加（P㩳0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平也增加明显（P㩳0.01），凋亡蛋白Bax的表达水平不明显（P㧐0.05）。 5. H2O2浓度在400μmol/L以上时，随着H2O2浓度的递增，p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、BCL-2的表达水平降低（P㩳0.05，P㩳0.01），而mTOR、P70S6K、S6表达变化不明显，同时Bax的蛋白表达明显增高（P㩳0.01）。 结论 氧化应激性刺激可以使mBMSCs的存活率降低，促使细胞凋亡，其机理可能与氧化损伤抑制mTOR及其下游信号通路的活性，特别是抑制蛋白的磷酸化有关；同时也与抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，增加凋亡蛋白Bax表达有关。 第二部分：姜黄素在BMSCs氧化应激性刺激中的作用及机制 方法: 1.实验分组：1）对照组（BMSCs常规培养，不加任何额外刺激），2）氧化应激损伤组（对照组+500μmol/L H2O2），3）姜黄素组（3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L姜黄素干预），4）雷帕霉素+姜黄素组（氧化应激组+50ng/mL的雷帕霉素+12.5μmol/L姜黄素）。 2. MTT法检测不同浓度姜黄素对BMSCs的抗氧化作用。 3. western blot检测经各组处理后BMSCs的Bax、Bcl-2蛋白表达水平，mTOR及其下游信号通路p70s6k、s6磷酸化蛋白的表达变化. 7.实验所有数据用SPSS17.0进行统计分析，组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD检验。 结果 1. MTT检测结果显示：在12.5μmol/L的姜黄素浓度时发挥最大抗氧化应激作用。 2.12.5μmol/L姜黄素组与氧化应激损伤组相比,p-mTOR、p-P70S6K、p-S6的表达水平增高（P㩳0.01）；mTOR信号通路阻断剂雷帕霉素可以明显阻断这一作用（P㩳0.01）。 3.12.5μmol/L姜黄素组与氧化应激损伤组相比,Bcl-2的表达水平上调，Bax的表达水平下调（P㩳0.01）；mTOR信号通路阻断剂雷帕霉素可以明显阻断这一作用（P㩳0.01）。 结论 一定浓度的姜黄素可以发挥抗氧化应激作用，其机制可能与活化mTOR通路，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，降低促凋亡蛋白Bax表达密切相关。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 韩冰;;亮氨酸对肌源卫星细胞mTOR信号通路的影响[J];食品科学;2013年19期
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1 崔明亮;心内膜下移植骨髓单个核细胞和间充质干细胞对猪急性心肌梗死疗效的实验研究[D];第四军医大学;2013年
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1 孙豫兰;mTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究[D];苏州大学;2013年
2 卜一;mTOR、FKBP38在SOD1-G93A转基因小鼠中的研究[D];河北医科大学;2013年
3 任倩;雷帕霉素抑制镉诱导小鼠脑神经细胞氧化应激和mTOR通路激活抗凋亡机理研究[D];南京师范大学;2013年
本文编号：1251998
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