维生素D与细胞自噬的相关性及自噬相关基因PTEN和AMPK的蛋白表达

发布时间：2017-12-11 10:37

  本文关键词：维生素D与细胞自噬的相关性及自噬相关基因PTEN和AMPK的蛋白表达

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【摘要】：目的：比较检测组的维生素D(VD)组（VD作用下)的老龄大鼠和正常饮食组老龄大鼠肝脏细胞发生自噬的程度及两组大鼠肾脏组织中自噬相关因子PTEN和AMPK的蛋白表达以探讨VD与自噬的相关性及VD引起自噬的具体机制，同时对生存曲线组维生素D(VD)作用下的老龄大鼠和正常饮食组老龄大鼠肝脏细胞发生自噬的程度进行比较，对生存曲线组的VD组和正常饮食组大鼠自然寿命及生存曲线进行分析和比较以探讨VD抗衰老的生物学效应。 方法：购买80只24月老龄雄性SD大鼠，先将其随机分为两个大组，即检测组和生存曲线组，然后将两大组再随机各分为两组，即检测组分为A组（VD组）和B组（正常饮食组），每组各20只，生存曲线组分为A1组(VD组）和B1组（正常饮食组），每组各20只，A组和A1组大鼠在正常饮食的情况下每天同一时间经灌胃给予最佳剂量的活性VD(经预实验得到最佳浓度1.0μg|kg)，B组和B1组在正常饮食的情况下分别用和VD等量的双蒸水进行灌胃。在VD干预第100天采集标本，检测组大鼠需要在活体状态下迅速取1mm3肝脏组织，然后放置4℃的冰箱进行保存,最后将检测组大鼠处死，分别取出各个大鼠的双侧肾脏组织，经生理盐水数次冲洗干净后将其中一个肾脏放于盛有多甲醛的小试管中固定待做免疫组化检测，另一个用锡纸包裹-80℃保存待做western blot检测。通过用透射电镜在不同的倍数下观察检测组的A组和B组肝脏细胞自噬泡的数量情况以确定各组肝脏细胞的自噬程度，然后进行拍照用统计软件分析两组数据，对A组和B组的自噬程度进行比较；用免疫组化方法检测从检测组的A组和B组大鼠中取出的肾脏PTEN、AMPK的蛋白表达，同样进行拍照用统计软件进行分析比较两组PTEN、AMAPK的蛋白表达量。用western blot方法检测从检测组的A组和B组大鼠中取出的肾脏PTEN、AMPK的蛋白表达，，也如上一样进行拍照用统计软件进行分析比较两组PTEN、AMAPK的蛋白表达量。生存曲线组大鼠同样需要在活体状态下取1mm3肝脏组织放置4℃的冰箱进行保存，肝脏取毕后将切口缝合，继续喂养，记录大鼠每天的体重及生理情况直至大鼠自然死亡，记录生存曲线组A1组和B1组大鼠各组自然死亡大鼠日期。用透射电镜在不同的倍数下观察生存曲线组的A1组和B1组肝脏细胞自噬泡的数量情况以确定各组肝脏细胞的自噬程度，然后同检测组一样进行拍照用统计软件分析两组数据，对A1组和B1组的自噬程度进行比较。通过软件对检测组A1组和B1组绘制生存曲线,然后进行进行生存分析，并对细胞自噬活性和大鼠生存时间进行关联性分析。 结果：1.在透射电镜下观察检测组和生存曲线组的VD组大鼠肝脏细胞，发现两组的细胞都有典型的自噬细胞的形态学改变。与正常饮食组相比，VD作用下的大鼠肝脏细胞自噬泡占细胞质总面积的比值均明显提高（P0.01）。2.免疫组化方法示检测组的VD组大鼠肾脏细胞PTEN和AMPK蛋白表达较正常组显著升高（P0.01）。3.western blot方法示检测组的VD组大鼠肾脏细胞PTEN和AMPK蛋白表达较正常组显著升高（P0.01）。4.利用SPSS18.0软件对生存曲线组大鼠绘制生存曲线，同时得到统计结果即细胞发生自噬的程度和大鼠寿命之间呈线性正相关(rs=0.880, P0.01)，因此VD可以延长老龄大鼠的寿命。 结论：1.透射电镜检测细胞自噬方法证实VD可增强细胞发生自体吞噬2.免疫组化方法检测大鼠肾脏细胞的PTEN和AMPK蛋白表达量也相应提高，western blot方法检测大鼠肾脏细胞的PTEN和AMPK蛋白表达量也相应提高，推测VD引起自噬过程中可能与PTEN及AMPK有关3.VD可以使老龄大鼠寿命延长，VD延长寿命的机制与细胞自噬相关。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363

【参考文献】

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1 卢瑞利;邵经浩;郭长青;;自噬相关基因Beclin1和PTEN在食管癌中的表达和意义[J];临床荟萃;2009年18期

本文编号：1278167