应用CS-SELEX技术筛选特异性结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B适配子的研究

发布时间：2017-12-14 23:31

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【摘要】：目的应用CS-SELEX(cell surface-system evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)非结构蛋白4B(non protein 4B,NS4B)特异性结合的ssDNA适配子,建立检测HCV NS4B的酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)方法。方法构建pDisplay-NS4B质粒,并转染至HepG2细胞中,在G418存在情况下连续筛选1个月,得到单克隆细胞群,经过Western blot以及流式细胞术验证,获得稳定表达NS4B的HepG2细胞。设计并合成随机序列ssDNA文库,以稳定表达NS4B的细胞为正向筛选靶细胞,以HepG2细胞为反筛细胞进行CS-SELEX技术筛选。每轮筛选获得的具有结合NS4B能力的ssDNA适配子,通过PCR扩增得到富集,随后通过不对称PCR获得下一轮筛选的ssDNA文库。经过16轮筛选,将亲和力最高的筛选产物克隆并测序,用ELONA方法检测适配子的亲和力。结果成功构建表面展示表达重组质粒pDisplay-NS4B。分别将该质粒转入HepG2细胞,通过G418筛选获得稳定表达HCV-NS4B的细胞系NS4B-HepG2。对CS-SELEX筛选的各轮适配子库进行亲和力测定,其中第14轮库适配子与NS4B的亲合力最高。分别对第14轮库中的单个适配子进行亲和力测定,以适配子ZN1和ZN5与NS4B的亲合力最高。ZN1和ZN5不仅能结合展示在细胞表面的NS4B蛋白,还能结合丙型肝炎病毒感染细胞(HCV cell culture,HCVcc)中的HCV-NS4B蛋白。结论适配子ZN1和ZN5对NS4B有高亲和力,这对研究HCV-NS4B致癌机制、HCV诊断以及治疗方面有潜在的应用价值。
【作者单位】： 武汉大学基础医学院免疫学系病毒学国家重点实验室湖北省过敏及免疫相关疾病重点实验室;
【基金】：国家重大传染病专项(No.2012ZX10003002-015) 国家自然科学基金项目(No.31221061,31270176,81471910和31370197) 国家杰出青年基金项目(No.81025008)
【分类号】：R373.21
【正文快照】： ***据世界卫生组织(WHO)统计,全球约有3%,即1.7亿~2.0亿人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)[1]。我国是HCV高感染率国家之一。HCV感染后,机体免疫系统往往不能将其清除,约80%的HCV感染者常发展成为慢性肝炎,其中有10%~***30%的患者发展为肝硬化、1%~5%发展为晚期肝癌(

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