冠状病毒木瓜样蛋白酶诱导自噬生物学效应研究

发布时间：2017-12-15 01:16

  本文关键词：冠状病毒木瓜样蛋白酶诱导自噬生物学效应研究

  更多相关文章： 冠状病毒NL63 木瓜样蛋白酶 自噬 Beclin1 STING

【摘要】：背景：细胞自噬（Autophagy）是通过溶酶体介导降解蛋白的高度保守过程，在维持细胞内环境稳态中起着重要作用。冠状病毒是一类拥有庞大RNA基因组的包膜病毒。目前人类冠状病毒包括hCoV-229E、hCoV-OC43、SARS-CoV、hCoV-NL63、 hCoV-HKU1和最近发现的人类新冠状病毒hCoV-EMC六种，其中NL63、HKU1和hCoV-EMC病毒是继SARS冠状病毒后出现的人类新发冠状病毒。NL63冠状病毒是由荷兰学者2004年首先报道，呈世界性分布，已成为人类呼吸道感染的主要新发病原之一。目前临床上尚无抗冠状病毒特效药物和预防疫苗。自噬与病毒感染过程密切相关，已成为抗病毒药物研发的重要靶点。冠状病毒木瓜样蛋白酶(Papain-like protease, PLP)在冠状病毒复制中起着重要作用。目前冠状病毒编码的PLP调控宿主细胞自噬及其反应机制尚不清楚。围绕这一问题本论文对冠状病毒编码的膜定位木瓜样蛋白酶(PLP-TM)功能进行深入的研究。 目的：以人冠状病毒NL63为例阐述冠状病毒与自噬的关系，，从冠状病毒木瓜样蛋白酶PLP角度具体研究冠状病毒是否诱导自噬，进一步拓展了冠状病毒木瓜样蛋白酶的功能，对阐明人类新发冠状病毒致病机理和研发抗病毒药物具有重要参考价值。 方法：首先，将人冠状病毒NL63木瓜样蛋白酶PLP与带有绿色荧光蛋白GFP的LC3B质粒共转染于细胞中，通过细胞免疫荧光染色技术确定NL63木瓜样蛋白酶PLP是否引起特征性GFP-LC3B点状聚集。其次，通过Western blot、免疫荧光染色技术和电子投射电镜技术检测PLP诱导自噬。进一步对机制进行研究，首先Western blot技术检测自噬蛋白p62的表达；免疫荧光染色技术检测PLP2-TM引起pmRFP-GFP-LC3绿色荧光和红色荧光蛋白标记点状自噬体聚集情况。分子克隆技术构建pcMV-Myc-Beclin1载体，通过免疫共沉淀技术研究PLP2-TM与Beclin1以及PLP2-TM与内源性LC3的相互作用。Western blot检测内源性Beclin1表达，免疫共沉淀技术检测PLP2-TM对Beclin1的泛素化水平影响情况。最后，通过免疫共沉淀技术检测PLP2-TM对STING分别与Beclin1和LC3相互作用的影响。 结果：1. PLP2-TM是冠状病毒编码自噬诱导蛋白：通过免疫荧光技术研究人冠状病毒NL63木瓜样蛋白酶PLP与自噬的关系，实验发现仅PLP2-TM可引起明显的绿色荧光蛋白标记自噬体聚集，而其他木瓜样蛋白酶比如PLP1、PLP1-TM和PLP2诱导自噬体聚集不明显。提示PLP2-TM具有诱导细胞自噬特性，是一种冠状病毒编码自噬诱导蛋白。 2. PLP2-TM诱导自噬现象：在HEK293T、Hela和MCF-7不同细胞中，PLP2-TM均引起绿色荧光蛋白标记的自噬体明显聚集，并促进自噬标准蛋白LC3-II表达。在PLP2-TM转染后不同时间，随着转染时间延长PLP2-TM诱导自噬体聚集更明显，并明显促进LC3-II表达。电子投射电镜结果显示，转染PLP2-TM实验组细胞出现明显自噬体特异性双层膜结构，阳性对照组细胞同样出现自噬溶酶体特异性单层膜结构，而阴性对照组细胞没有观察到明显的自噬体相关膜型结构。实验发现自噬抑制剂3-MA特异性抑制PLP2-TM促进的LC3-II表达。 3. PLP2-TM诱导不完全自噬效应的研究：实验组中PLP2-TM促进LC3-II表达增多但对自噬底物p62蛋白稳定性表达没有影响，阳性对照组中Rapamycin激活LC3-II表达且促进p62蛋白表达降低，暗示PLP2-TM诱导不完全自噬效应；PLP2-TM引起pmRFP-GFP-LC3质粒表达中绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标记自噬体的明显聚集，阳性对照组不完全自噬诱导剂CQ处理转染pmRFP-GFP-LC3质粒的细胞中观察到既有绿色荧光蛋白标记自噬体聚集又有红色荧光蛋白标记自噬体聚集，实验组转染PLP2-TM与阳性对照CQ诱导结果一致，而阴性对照组细胞中红色荧光蛋白标记自噬体聚集明显，表明PLP2-TM诱导不完全自噬效应。 4. PLP2-TM诱导自噬机制研究：（1）PLP2-TM与LC3相互作用：PLP2-TM引起明显的绿色荧光蛋白标记自噬体聚集并且与绿色荧光蛋白eGFP-LC3B标记自噬体共定位；免疫共沉淀实验中显示PLP2-TM与内源性LC3免疫共沉淀，暗示着在冠状病毒感染过程中冠状病毒可以通过PLP2-TM定位于自噬体膜上为冠状病毒复制提供场所。（2）PLP2-TM与Beclin1相互作用：成功构建pcMV-Myc-Beclin1表达载体；免疫共沉淀实验结果显示PLP2-TM分别在过表达体系和内源性体系中与Beclin1相互作用。本研究结果提示冠状病毒编码的木瓜样蛋白酶可以类似其他病毒蛋白一样通过结合Beclin1阻断自噬溶酶体的形成诱导不完全自噬效应为病毒复制提供场所。（3） PLP2-TM通过去泛素酶活性降低Beclin1泛素化水平促进其表达：PLP2-TM在HEK293T、Hela和MCF-7不同细胞系中促进内源性Beclin1表达；并且在HEK293T细胞中免疫共沉淀实验结果显示PLP2-TM明显降低Beclin1泛素化水平，前期研究表明PLP2-TM具有DUB酶活性，暗示着PLP2-TM通过降低Beclin1的泛素化水平促进Beclin1表达。5. PLP2-TM对STING与Beclin1相互作用的影响：在HEK293T细胞中过表达PLP2-TM，STING和Beclin1，免疫共沉淀实验处理，结果发现PLP2-TM促进STING与Beclin1相互作用；LC3与Beclin1同为自噬调节蛋白但PLP2-TM对STING与LC3之间作用没有影响。本部分研究结果可能进一步解释PLP2-TM通过STING负调控宿主天然免疫。 结论：NL63编码的木瓜样蛋白酶（PLP）是一种自噬诱导蛋白，PLP2-TM可能通过去除Beclin1泛素化水平并且与Beclin1相互作用诱导不完全自噬活性；同时PLP2-TM能够促进STING与其诱导的自噬膜上关键分子Beclin1相互作用，提示PLP2-TM通过诱导的自噬体膜上Beclin1分子滞留STING，这可能阻止STING信号向下传导从而负调控天然免疫反应。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 朱娜;谭文杰;;细胞自噬对人冠状病毒复制与致病性的影响[J];病毒学报;2010年06期

2 赵美;臧伟进;;巨自噬在心脏疾病调节中的双向作用[J];生理科学进展;2011年02期

3 王凯;郑洋;邢雅玲;陈晓娟;陈忠斌;;细胞自噬在病毒感染与免疫调节中的作用机制[J];中国生物化学与分子生物学报;2011年11期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 张晓延;肠道病毒71型诱导细胞自噬、凋亡及相互调控关系的研究[D];北京协和医学院;2011年

本文编号：1290083