人去乙酰化酶SIRT1的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

发布时间：2017-12-19 12:29

  本文关键词：人去乙酰化酶SIRT1的基因克隆及在大肠杆菌中的表达　出处：《郑州大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：Sirtuin家族在生命体中广泛存在，是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的III类组蛋白去乙酰化酶，迄今为止在哺乳动物中发现的sirtuin家族成员有SIRT1~SIRT7，其中对SIRT1的研究最为广泛。在SIRT1介导的去乙酰化反应中，NAD+以共同底物的角色参与反应，该反应过程主要是在SIRT1的催化作用下将作用底物中的乙酰基转移到NAD+的ADP核糖基上，最终产物包括去乙酰化后的SIRT1底物，，以及烟酰胺（NAM）和O-乙酰基-ADP-核糖。SIRT1的作用底物不仅有组蛋白底物，还有一部分非组蛋白底物，通过对这些底物的去乙酰化作用，SIRT1参与调控了机体的众多生理过程，例如细胞的凋亡、分化以及衰老，基因的表达调控、能量代谢等。同时SIRT1与肿瘤的发生发展有着重要的联系，但是其主要的作用仍存在着争议，这主要是因为在癌症中SIRT1究竟扮演着促癌因子还是抑癌因子的角色尚不能成定论，且在不同的肿瘤组织中其表达水平不够统一。尽管如此，SIRT1作为一个潜在的药物靶点，已经得到了越来越多的科学家的关注。本实验室拟采用基因工程的方法制备具有高生物活性和特异性的SIRT1重组蛋白，并对体外筛选SIRT1激动剂与抑制剂奠定了物质基础。 根据文献调研对人SIRT1蛋白选取其193-747位氨基酸片段作为活性片段，因所得cDNA的不正确性，采用Overlap PCR的方法对其进行了定点突变，获得了序列完全正确的活性片段，并将该片段克隆于pGEM-T Easy克隆载体中。鉴定正确之后，将正确的活性片段的基因片段连接入表达载体pET28b中，构建了重组表达载体pET28b/SIRT1。将得到的重组表达载体pET28b/SIRT1转化至E.coli BL21(DE3)，加入IPTG后进行诱导表达。提取蛋白后，经镍柱亲和层析纯化后得到目的蛋白。 成功构建了原核重组表达质粒pET28b/SIRT1，并用该质粒转化E.coliBL21(DE3)。重组蛋白以可溶蛋白形式表达，确定诱导表达的条件为：重组表达宿主菌37℃振摇培养至OD600约为0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃培养过夜。纯化后可以得到电泳纯度大于90%的重组蛋白。最后采用荧光定量比色法对纯化后的重组蛋白进行了活性检测，选用共价偶联的短肽Ac-Arg-His-Lys-Lys(Ac)-AMC作为SIRT1的去乙酰化底物，最终结果显示未加底物组与加底物组的荧光值存在明显的差异，证明该重组人SIRT1蛋白在外具有稳定的去乙酰化作用。且该活性检测法可以作为SIRT1抑制剂与激活剂的筛选模型。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：1307989