b型流感嗜血杆菌多糖制备工艺优化及其与D蛋白结合的研究

发布时间：2017-12-23 08:22

  本文关键词：b型流感嗜血杆菌多糖制备工艺优化及其与D蛋白结合的研究　出处：《北京协和医学院》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b, Hib)结合疫苗可以保护5岁以下婴幼儿免受Hib细菌引起的多种侵袭性疾病感染。现在国内上市的结合疫苗是以破伤风类毒素为载体,但其具有的局限性如产生的免疫抑制和毒性回复现象,因此寻找安全有效的新型载体成为结合疫苗研究的新方向。在国外上市的流感嗜血杆菌D蛋白作为疫苗载体已应用于十价肺炎球菌多糖结合苗中,其安全性和免疫性均较好。目前,国内尚没有以D蛋白为载体的Hib结合疫苗的报道。 第一部分：b型流感嗜血杆菌多糖及D蛋白载体制备工艺的研究 应用阳离子表面活性剂CTAB沉淀阴离子多聚物时,发酵液上清的pH对Hib荚膜多糖的产量有重要影响。三批发酵液上清样品分别调节pH至12个不同水平(5.25-8.0),纯化过程按照Gotschlich等人的纯化步骤进行。Hib荚膜多糖溶解pH分别调至5.25、7.0、8.0并进行1HNMR分析。当发酵液上清pH为6.5时,Hib精糖的回收率较高,且其结构与要求保持一致。对三批制备的荚膜多糖的粗糖和精糖重量进行统计分析,其结果即p0.01(粗糖：0.001,0.001及0.001；精糖：0.002,0.01及0.001)。故研究表明发酵液上清pH对Hib精糖的产量有显著影响。 本文通过对Hib D蛋白基因进行扩增,去除信号肽的hpd基因片段插入pET43.1a表达质粒,并转化如大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,D蛋白可溶性表达。该蛋白经过硫酸铵沉淀,经DEAE sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化得到高纯度的重组D蛋白后,通过Western blot的方法证明免疫反应性较好。 第二部分：Hib多糖与D蛋白结合疫苗的制备 采用CDAP法在不同pH条件下活化Hib荚膜多糖,再通过乙二酰肼(ADH)与D蛋白共价结合,制备Hib荚膜多糖与其D蛋白结合物原液,并对三批结合物原液的各项指标进行检测。结合物原液经Sepharose4FF凝胶层析柱纯化出多糖蛋白结合物。对三批结合物原液的多糖、蛋白、高分子结合物、分子量、EDAC残余含量、免疫原性、无菌检查和内毒素等各项指标进行检测。获得的结合物原液免疫BALB/c小鼠,应用ELISA法检测血清中的IgG抗体水平,评价其免疫原性。三批结合物原液以上检测指标均符合药典要求。衍生物中ADH含量对结合物的免疫原性有重要影响。用CDAP活化工艺制备的Hib荚膜多糖-D蛋白结合物适宜制备结合疫苗。为以D蛋白为载体的Hib结合疫苗的制备及五价联苗的研制奠定实验基础
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378;R392

【参考文献】

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本文编号：1323148