TLR4和核仁素受体介导呼吸道合胞病毒感染中枢神经元的初步研究

发布时间：2017-12-26 09:08

本文关键词：TLR4和核仁素受体介导呼吸道合胞病毒感染中枢神经元的初步研究　出处：《安徽医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)为副粘病毒科肺炎病毒属,是有包膜非节段性的单股负链RNA病毒,同时也是世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的最主要病原,在婴幼儿中发病率和死亡率较高。然而RSV也可感染神经系统,引起神经系统症状,如嗜睡、抽搐、惊厥、癫痫等,目前已有多项关于RSV诱发脑病的临床病例报道,但RSV感染神经系统的机制目前尚不明确,有待进一步研究。中枢神经元细胞是神经系统的功能细胞,它的异常可能直接导致脑病症状的发生。已有文献表明神经元细胞上同时表达TLR4,目前已知小鼠神经元细胞膜上表达TLR4受体,小鼠小胶质细胞膜上表达核仁素,而小鼠神经元上是否表达核仁素受体目前尚未见报道,有待确认,并且这两种受体可以同时识别RSV F蛋白,因此我们设想RSV可能通过这两种受体的介导作用而直接感染神经元,引起神经元损伤病变。TLR3和TLR7是与RSV感染密切相关的受体,其中TLR7可以识别RSV的单链RNA, TLR3可识别RSV复制过程中所产生的双链RNA,有文献报道称TLR3的激活可对神经元起保护作用。本实验室前期实验证明,在RSV体外感染A549细胞及体内感染BALB/c小鼠后,TLR3/TLR7表达量都呈上升趋势,本文通过检测神经元细胞TLR3/TLR7表达量的变化以揭示病毒感染神经元后细胞活化情况。本课题拟用RSV体外直接接种中枢神经元,激光共聚焦显微镜技术检测病毒与受体结合情况,western blot技术检测TLR4、核仁素表达情况,并检测病毒感染后TLR3、TLR7活化及细胞损伤情况等,初步探讨TLR4与C23介导RSV感染神经元及损伤的相关机制。目的：通过RSV接种中枢神经元,观察细胞内病毒所在位置及神经元病变损伤,探讨RSV能否感染神经元；通过检测RSV感染神经元后RSVF蛋白与受体TLR4、C23结合情况及细胞膜上TLR4和C23受体蛋白表达量变化,以及细胞内TLR3、TLR7受体蛋白的活化,细胞凋亡损伤情况等,初步研究TLR4和C23受体在RSV感染及损伤神经元过程中所起的作用,为临床婴幼儿RSV中枢神经系统感染的机理研究、治疗和预防等提供新的思路。方法：(1)用RSV直接接种体外培养的中枢神经元N2a细胞,在普通光学显微镜下观察细胞病变情况,并用激光共聚焦显微镜观察细胞核形态变化,然后用透射电镜分别在不同的时间点观察RSV感染能否进入N2a细胞,病毒在细胞的位置。(2)激光共聚焦显微镜技术观察RSV感染N2a细胞后细胞形态变化,病毒F蛋白与TLR4和核仁素受体结合情况。(3)免疫印迹法(Western-blot)检测RSV感染N2a细胞不同时间点细胞膜受体TLR4、C23及细胞内受体TLR3、TLR7蛋白水平的变化,以未感染的细胞作为对照组。(4)流式细胞术检测RSV感染N2a细胞不同时间点细胞的凋亡病变情况。结果：(1)透射电镜结果显示,RSV感染N2a1h, N2a细胞膜边缘可见RSV病毒颗粒；RSV感染N2a2h和4h胞内可见RSV病毒颗粒；感染12h和24h细胞内病毒颗粒增加；感染2d在细胞内可见病毒包涵体；感染4d病毒量进一步增加,并且细胞形态发生变化。 (2)激光共聚焦显微镜技术结果显示,RSV感染N2a细胞1h,F蛋白与TLR4及核仁素受体都有结合,但与TLR4结合更多。RSV感染N2a细胞4d,可见细胞核形态发生变化。 (3) western blot测定结果显示,正常组中TLR4/C23、TLR3/TLR7蛋白水平表达量较低,而在RSV感染组,随着感染时间增加,TLR3/TLR7表达不断上调。TLR4/C23在RSV感染1h、2h和4h表达量逐渐增高,4h后表达量降低,到感染第4天,下降到与正常水平相接近。 (4)流式细胞术检测结果显示,RSV感染N2a细胞0h、1h、2h、4h、12h和24h,细胞均无早期凋亡及晚期凋亡变化,感染2d后可见细胞早期凋亡比例超过30%,感染3d和4d,早期凋亡比例和晚期凋亡比例均超过30%,有统计学意义,并且在感染的第2d-4d,随着感染时间点的延长,早期凋亡比例呈降低趋势,晚期凋亡比例呈上升趋势。结论：RSV可直接感染中枢神经元N2a细胞,引起病变,同时可引起细胞膜受体TLR4和C23及细胞内受体TLR3和TLR7蛋白表达量的变化,并且认为RSV可通过与N2a细胞膜上的TLR4和C23受体结合从而进入并感染N2a细胞,其中以TLR4的结合为主。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373

【参考文献】