幽门螺杆菌HspA和UreB在蚕蛹中的表达及表达产物免疫活性的鉴定研究

发布时间：2017-12-27 11:04

本文关键词：幽门螺杆菌HspA和UreB在蚕蛹中的表达及表达产物免疫活性的鉴定研究　出处：《苏州大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种能定植在胃和十二指肠粘液和粘膜的具有特殊能力螺旋形革兰氏阴性细菌。目前,世界上有50%以上的人口感染有这种病原菌,其中百分之二十的感染者将会引起慢性胃炎、消化性和十二指肠溃疡、胃癌和粘膜相关淋巴组织瘤的临床症状。世界卫生组织已把它作为Ⅰ类致癌原。在发展中国家更加广泛流行。目前,对有这种明显疾病症状个体治疗方法主要是用一种质子泵结合二种或三种抗生素的联合疗法。有80%的根除率和随后的临床症状的改善已经成为标准的治疗方法。该治疗是有效的,但是,随着抗菌素抵抗的增加、重新感染、并发症和高治疗费用限制了对幽门螺杆菌相关疾病的治疗,因此,人抗幽门螺杆菌感染的保护和治疗疫苗可能是控制这种感染的有效和经济的途径。给实验动物进行免疫实验的结果显示,多种免疫方法在动物模型实验中呈现幽门螺杆菌定植数大大减少。治疗和保护疫苗中大多数是以应用已了解的与幽门螺杆菌感染相关的病原菌的抗原为基础的。许多研究已证明用幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)免疫小鼠,能够清除小鼠胃中的幽门螺杆菌感染,幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)也具有很强免疫原性,可以作为幽门螺杆菌疫苗的候选蛋白。 1.利用Bac-to-Bac系统在蚕蛹中表达幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位和尿素酶B亚单位家蚕核多角体杆状病毒表达系统有高表达水平和低成本等优点。为了用家蚕表达螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)和尿素酶B亚单位(UreB),我们将hspA基因和egfp基因克隆至pFastBacDual载体构建了pFastBacDual(-EGFP)(HspA)供体载体,ureB基因克隆至pFastBacDual载体构建了pFastBacDual-UreB,上述载体分别转化E. coli BmDH10Bac,通过筛选和鉴定获得了重组Bacmid-(EGFP)(HspA)和Bacmid- UreB;提取重组Bacmid-(EGFP)(HspA )和Bacmid-UreB DNA,转染BmN细胞获得重组杆状病毒BmNPV-(EGFP)(HspA)和BmNPV- UreB;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在感染重组杆状病毒96 h的蚕蛹血淋巴中可检测到13kDa和62kDa的特异性条带,表明幽门螺杆菌的HspA、UreB在蚕蛹中成功表达,ELISA检测结果显示HspA、UreB的表达水平分别为0.52mg/ml和0.49mg/ml蚕血淋巴。 2.EGFP与靶蛋白非融合共表达确定表达HspA蚕蛹中的最佳收获时间为了确定重组蛋白在蚕蛹中表达的时间过程和表达靶蛋白蚕蛹的最佳收获时间,传统的方法是从感染病毒72h后,开始每间隔12h收集蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴,通过SDS-PAGE或ELISA分析来确定靶蛋白的表达时间相,据此,确定收获蚕蛹的时期。该过程难以实时追踪靶蛋白的表达时相。为了实现靶蛋白表达水平的可视和实时追踪,通过非融合的方式用P10和Pph启动子分别控制EGFP和HspA基因,构建重组杆状病毒,实验结果显示,接种重组病毒蚕蛹的荧光强度与重组HspA的表达水平有直接的对应,表明可以根据蚕蛹的荧光强度确定表达HspA在蚕蛹中的最佳收获时间。 3.口服蚕蛹表达的UreB和HspA对小鼠抗幽门螺杆菌感染的免疫保护和治疗效果评价幽门螺杆菌感染是一个重大的全球公共卫生问题,其疫苗已经成功地应用人类预防和治疗幽门螺杆菌感染中。口服免疫保护是抗幽门螺杆菌感染的一个很好的策略,因此,我们在成功建立幽门螺杆菌感染小鼠模式的基础上,探讨了口服蚕蛹表达的UreB和HspA对小鼠抗幽门螺杆菌感染的免疫保护作用,并对其疗效进行了评价。结果显示,重组UreB和HspA口服免疫小鼠血清中特异性抗体滴度比对照组小鼠有明显提升;口服含重组UreB蛋白蚕蛹粉的小鼠,细菌活体培养和PCR检测有20%动物(n=10)胃幽门螺杆菌呈现阳性,尿素酶测试有10%动物(n=10)胃幽门螺杆菌呈现阳性,而未免疫组上述三种测试方法100%动物(n=10)胃幽门螺杆菌呈现阳性。表明口服重组抗原能诱导抗幽门螺杆菌感染免疫保护反应。
[Abstract]:Helicobacter pylori (Hp) is a kind of special spirally Gram-negative bacteria capable of colonizing mucus and mucous membrane of the stomach and duodenum. At present, more than 50% of the world's population is infected with this pathogen, of which twenty percent of the infected people will cause chronic gastritis, peptic and duodenal ulcer, gastric cancer and mucosa associated lymphoid tissue tumors. The WHO has taken it as a type I carcinogen. It is more popular in developing countries. At present, individual treatments for the symptoms of this obvious disease are mainly combined with a proton pump combined with two or three kinds of antibiotics. 80% of the eradication rate and the improvement of subsequent clinical symptoms have become the standard treatment. The treatment is effective, however, with the increase in antibiotic resistance, re infection, complications and high treatment cost limits on Helicobacter pylori related diseases treatment, therefore, protection against Helicobacter pylori infection and vaccine therapy might be a way to control the economy and the infection effectively. The results of immunization experiments on experimental animals showed that the number of Helicobacter pylori colonization was greatly reduced in animal model experiments. Most of the vaccines for treatment and protection are based on the application of the known antigen of the pathogenic bacteria associated with Helicobacter pylori infection. Many studies have demonstrated that with Helicobacter pylori urease B subunit (UreB) immunized mice can remove Helicobacter pylori in mouse stomach infection of Helicobacter pylori heat shock protein A subunit (HspA) also has strong immunogenicity, as Helicobacter pylori vaccine candidate protein.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392-33

【参考文献】