p55PIK：慢性炎症分子干预新靶点

发布时间：2017-12-28 00:32

  本文关键词：p55PIK：慢性炎症分子干预新靶点　出处：《华中科技大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 第一部分P55PIK及其N末端24个氨基酸对LPS诱导下HaCaT细胞释放炎性因子的干预作用 目的： 1.观察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的调节亚单位—p55PIK氨基端24个氨基酸(N24)对人角质形成细胞株—HaCaT细胞增殖的影响。 2.观察不同浓度以及不同时间脂多糖刺激下HaCaT细胞释放炎性因子TNF-α的变化。 3.观察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的调节亚单位p55PIK及其氨基端24个氨基酸对脂多糖刺激HaCaT细胞释放细胞因子TNF-α、IL-6IL-8的影响,为临床治疗工作提供理论依据。方法： 利用分子生物学手段构建并表达纯化了含有PI3K-p55PIK-N末端24个氨基酸的TAT-N24融合多肽、腺病毒AD-N24-GFP和含有PI3K-p55PIK的腺病毒AD-p55PIK-GFP,能够高效的携带N24或p55PIK进入细胞内。以人角质形成细胞株—HaCaT细胞为研究对象,以脂多糖(lipopolysaccharides LPS)刺激为主要诱导方式,探索N24对HaCaT细胞增殖的影响,应用CFDA标记法检测细胞增殖情况；探索LPS的最佳刺激时间和刺激浓度,采用ELISA法、Real time-PCR法检测N24及p55PIK干预下TNF-α、IL-6和IL-8蛋白水平及mRNA水平的变化。 结果： 1.成功构建并表达纯化了TAT-N24融合多肽和腺病毒AD-N24-GFP,AD-p55PIK-GFP; TAT-N24能有效阻滞HaCaT细胞周期进程于G0/G1期,S期和G2/M期细胞减少,TAT-N24组各期细胞分布为G0/G1期(80.37±1.09)%,S期(7.81±1.97)%,G2/M期(11.82±1.71)％,而对照多肽组各期细胞分布为：G0/G1期(58.54±2.06)%, S期(26.34±1.69)%, G2/M期(15.12±1.91)％,空白对照组各期细胞分布为：G0/G1期(60.14±2.06)%,S期(25.32±1.78)%,G2/M期(14.34±1.39)%,组间有显著性差异(p0.05)；BrdU阳性细胞比例显示：TAT-N24组R2为：(8.37±2.06)%,对照多肽组R2为：(28.14±4.69)%,空白对照组R2为：(26.73±3.58)%,提示TAT-N24能有效抑制]HaCaT细胞的DNA合成；CFDA检测显示TAT-N24组增殖指数(PI)为：30.75±3.66,对照多肽组增殖指数(PI)为：47.81±5.66,空白对照组增殖指数(PI)为：50.16±5.33,有显著差异(p0.05)提示TAT-N24能有效抑制]HaCaT细胞的增殖。 2.成功构建LPS刺激下HaCaT细胞释放炎性因子的模型。正常状态下的HaCaT细胞有TNF-α、IL-6和IL-8的自发性分泌；LPS刺激后的HaCaT细胞TNF-α、IL-6和IL-8的分泌量明显增加这与银屑病患者皮损中细胞因子的变化非常相似。ELISA法确认LPS最佳的刺激浓度和刺激时间,使HaCaT细胞释放炎性因子TNF-α水平达到最高。 3.TAT-N24作用于HaCaT细胞后其TNF-α的分泌量有一定的增加,它们可能参与了对正常皮肤的炎性刺激作用,一定浓度TAT-N24可有效抑制LPS刺激HaCaT细胞释放TNF-α、IL-6和ⅠL-8。ELISA检测结果显示：相对于LPS刺激组,TAT-N24干预组的细胞上清内TNF-α、IL-6和IL-8的浓度分别由208.06±30.18pg/ml、86.4±9.78pg/ml和260.59±54.05pg/ml下降至121.78±22.26pg/ml、53.18±7.36pg/ml和125.08±35.17pg/ml。real time-PCR结果显示：正常HaCaT细胞可以分泌一定程度的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8。内毒素(LPS)刺激HaCaT细胞后,炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的释放增加,加入TAT-N24干预后,上述三种促炎因子的表达降低。而AD-N24-GFP也可以抑制LPS刺激HaCaT细胞释放炎性因子(TNF-α、IL-6和IL-8)的表达,其作用和TAT-N24功能类似；AD-p55PIK-GFP自身也可以导致炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的释放增加,加入LPS刺激后,炎性因子的释放增加,与空白对照组及无AD-p55PIK-GFP干预下LPS刺激组比较,其差异具有统计学意义。 4.real time-PCR法检测结果显示：正常HaCaT细胞有一定程度的TNF-α、IL-6和IL-8mRNA的表达,LPS刺激后,上述三种炎性因子有不同程度的升高。HaCaT细胞经TAT-N24和AD-N24-GFP预先处理过后,LPS刺激下炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8相对于未预先处理组mRNA水平表达降低；感染AD-p55PIK-GFP后,HaCaT细胞在LPS刺激下炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8mRNA水平表达升高。 第二部分p55PIK及其N末端24个氨基酸调控LPS诱导下HaCaT细胞内炎性反应的机制研究 目的： 探讨N24及p55PIK在HaCaT细胞内对TLR2、TLR4及其信号转导通路的调控机制。 方法： 免疫组化检测NF-κB P65在HaCaT细胞内的表达情况；免疫荧光激光共聚焦显微镜分析NF-κB P65在HaCaT细胞内的转位表达情况；Western Bloting检测分析AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP干预后,LPS刺激下HaCaT细胞内TLRs信号通路蛋白的表达情况。 结果： 1、免疫细胞化学结果提示正常HaCaT细胞内NF-KB P65蛋白主要表达在细胞浆内,低染,LPS刺激后P65蛋白转位入核,在核内表达增加,高染；感染AD-N24-GFP后NF-κB P65在细胞核内的表达降低。 2、免疫荧光后激光共聚焦显微镜分析结果显示正常HaCaT细胞内NF-κB P65蛋白主要表达在细胞浆内,LPS刺激后NF-κB P65转位入核,在核内表达增加；感染AD-N24-GFP后NF-κB P65蛋白在核内的表达降低。 3、Western Bloting结果提示LPS刺激下HaCaT细胞内TLRS通路中各蛋白均有不同程度的改变,TLR2、TLR4表达增加,它们在4小时内达到高峰,随后逐渐降低,但到24小时仍然高于正常细胞表达水平；感染AD-N24-GFP后,其表达情况未见明显变化,感染AD-p55PIK-GFP后TLR2及TLR4表达均增加；MyD88蛋白表达随LPS刺激时间的增加而增加,到8小时达到最高点,然后逐渐下降但24小时内仍高于正常水平,感染AD-N24-GFP后MyD88表达降低,而感染AD-p55PIK-GFP其表达增加；磷酸化Akt(p-Akt)表达随LPS刺激时间增加而增加,在2小时达到最高峰,以后逐渐降低,到24小时已经基本恢复到正常水平,感染AD-N24-GFP后其表达情况为未见明显改变；感染AD-p55PIK-GFP后p-Akt表达增加；ERKs从30分钟起磷酸化激活增强(P0.05),4小时达高峰(P0.05),其后逐渐下降,但直至24小时仍显著高于基础水平(P0.05)。JNK/SAPK、p38亦有与ERKs磷酸化激活相同的变化趋势,所不同的是,JNK/SAPK磷酸化在4h高峰值以后迅速下降(P0.05),至24小时已经回复到基础水平。p38磷酸化在4h高峰后迅速下降(P0.05),但24小时仍略高于基础水平(图2)。感染AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP后其表达情况为未见明显改变；IκB-α于LPS刺激后30分钟出现表达降低,到4小时达到最低点,到16小时开始逐步恢复,但到24小时仍然低于正常水平。感染AD-N24-GFP后,IκB-α表达相对于LPS刺激组增加；感染AD-p55PIKP后,IKB-α表达相对于LPS刺激组表达未见明显变化。 结论： AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP通过干预TLRs/MyD88介导的信号通路来影响LPS刺激下HaCaT细胞释放炎性因子的变化。
[Abstract]:The intervention of 24 amino acids at the first part of P55PIK and its N terminal on the release of inflammatory factors in HaCaT cells induced by LPS
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

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