瘦素对大鼠骨髓基质干细胞向软骨细胞分化过程及IGF-1表达的影响

发布时间：2017-12-28 07:14

本文关键词：瘦素对大鼠骨髓基质干细胞向软骨细胞分化过程及IGF-1表达的影响　出处：《华北煤炭医学院》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：关节软骨主要由软骨细胞和细胞基质构成,其功能是传导及分布载荷、维持和承受关节面的接触应力。关节软骨是无血管、淋巴管和神经的组织,所以自我修复能力相当有限,轻微伤害就有可能导致渐进式的损伤。关节软骨缺损的修复是临床上很棘手的问题。组织工程方法的出现给人们提供了可能最终解决问题的理想途径。以往构建的组织工程化软骨多选用软骨细胞作为种子细胞,存在着许多缺点:如供区功能障碍,获得细胞量小,细胞在体外扩增过程中易发生去分化,而异体软骨细胞存在着免疫原性及潜在携带病毒的可能性。而骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)作为软骨细胞的前提细胞,来源易得,取材方便,增殖能力强,可在体外大规模扩增而不丢失多分化潜能,并且异体移植时排斥反应小。它是一类具有多向分化潜能的干细胞,有自我复制、高度增殖和多向分化的能力,在特定培养条件下可向骨、软骨、神经胶质细胞、心肌、骨胳肌、脂肪细胞、血管内皮细胞等间叶组织细胞转化,故又将这些细胞称为间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)。BMSCs向软骨诱导分化的方法已较成熟,被认为是软骨组织工程最有价值的种子细胞。在体内外向软骨细胞分化增殖过程中常需要某些特定因子的作用,如TGF-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenet- ic protein, BMP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)等。它们通过自分泌、旁分泌等方式,作用在BMSCs向软骨细胞诱导分化的各个阶段。 IGF是一类结构上类似于胰岛素原的多肽,由骨、软骨和其他多种组织合成,对多种组织和细胞起有丝分裂原作用。IGF能促进软骨细胞分裂增殖,增强细胞功能,促进蛋白多糖及II型胶原的合成。Madry等研究表明IGF-1可促进BMSCs向软骨细胞分化,还可抑制TGF-β1引起的细胞外焦磷酸盐的积聚,防止焦磷酸钙结晶的形成和进一步成骨,是TGF-β1重要的辅助因子。临床观察显示,成人血清瘦素水平与循环中的IGF-1呈显著正相关。瘦素是一种由肥胖基因(ob)编码、白色脂肪组织产生的低分子量多肽蛋白,参与调节能量代谢、食欲和生长发育。近年来,国内外对瘦素的研究涉及多个领域,发现瘦素与多种疾病包括肥胖、糖尿病、高血压、肾功能衰竭、骨质疏松、乳腺癌等都有密切关系。Cornish等证实人类关节软骨细胞上存在瘦素受体,瘦素还能促进羊和狗软骨细胞的增殖,对成年小鼠全身应用瘦素能增加骨骺生长板的厚度。将瘦素注入大鼠的膝关节后,可以刺激两种软骨生长因子,即IGF和TGF-β的表达,继而增加蛋白多糖的合成。Maor等认为,在离体培养中,瘦素可通过直接作用于生长板软骨细胞上的受体,来促进软骨细胞前体细胞的增殖,增加下颌骨髁软骨细胞的增殖和分化活性,其中,IGF-1通路可能起着重要的介导作用。故我们可以推测,瘦素可能通过IGF-1影响BMSCs的软骨化过程,促进细胞外基质的合成。目前关于瘦素对BMSCs的作用报道还较少,本实验采用瘦素对体外培养的大鼠BMSCs进行干预,观察细胞的增殖及细胞内IGF-1以及细胞外基质的表达情况,以了解瘦素对于体外培养的大鼠BMSCs的作用及其机制,为临床上瘦素参与软骨损伤的修复提供一定的理论依据。目的本课题旨在探讨: 1.在体外培养的大鼠BMSCs向软骨细胞分化早期(72h),瘦素对大鼠BMSCs增殖的影响; 2.在基因水平测定不同浓度瘦素对BMSCs向软骨细胞分化过程中IGF-1表达的影响; 3.瘦素作用于体外培养的大鼠BMSCs向软骨细胞分化过程中的最适效应浓度。综合以上结果,探讨瘦素在BMSCs向软骨细胞诱导分化中的影响及其作用机制,从而更好地指导临床治疗骨性关节炎(osteoarthritis,OA)及促进软骨组织工程的发展。方法 1采用体外细胞培养方法,选用4周龄SD大鼠的BMSCs作为实验研究材料。 2对培养的大鼠BMSCs进行形态观察。 3将培养的BMSCs传代至3代,随机分为6组,第1组为空白组,加入诱导培养基(DMEM, 5㳠胎牛血清,含重组人TGF-β1 10 ug/L,地塞米松10-7 mol/L ,维生素C 50μg/L),后5组为实验组,分别加入含0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml瘦素的诱导培养基。 4用MTT法测定不同浓度瘦素作用于体外培养BMSCs的细胞增殖情况。 5采用免疫细胞化学法检测不同浓度瘦素作用于体外定向诱导培养BMSCs是否分泌II型胶原。 6采用PCR法检测不同浓度瘦素作用于体外定向诱导培养BMSCs表达IGF-1的情况。 7用SPSS15.0软件对结果进行统计学分析。结果 1采用细胞体外培养方法成功培养BMSCs,并通过形态观察得到证实。采用免疫细胞化学法证明转化后的细胞为软骨细胞。 2在前24h,各实验组细胞的增殖情况均与对照组有显著差异(P0.05);在48h~72h,加入10 ng/ml浓度瘦素的实验组OD值明显增高,与其他各组均有显著差异(P0.05)。 3经瘦素刺激的各实验组定向诱导培养BMSCs表达IGF-1具有不同程度的增加,最大效应浓度为10ng/ml,而高浓度的瘦素的促进作用并不明显。结论 1瘦素在BMSCs向软骨细胞分化早期可以促进细胞增殖。 2瘦素可通过提高BMSCs中IGF-1的表达,对BMSCs向软骨细胞定向分化起到促进作用。
[Abstract]:Articular cartilage is mainly composed of chondrocytes and cell matrix, which function to transmit and distribute load, maintain and bear the contact stress of articular surface. Articular cartilage is a vascular, lymphatic, and nerve tissue, so the ability to repair itself is quite limited and slight injury may lead to progressive injury. The repair of articular cartilage defect is a difficult problem in clinical. The emergence of organizational engineering methods provides an ideal way for people to eventually solve the problem. The construction of tissue engineered cartilage with cartilage cells as seed cells, there are many shortcomings such as: for cell dysfunction, a small amount of cells during in vitro expansion easy to differentiate, and allogeneic chondrocytes exist the possibility of immunogenicity and potential virus. Bone marrow stromal cells (BMSCs), as the prerequisite cell of chondrocytes, is easy to obtain, easy to obtain and proliferative, and can be amplified in large scale without losing the potential of multiple differentiation. It is a kind of pluripotent stem cells, capable of self replication, highly proliferation and differentiation, in specific culture conditions can be transformed into bone, cartilage, glial cells, myocardium, skeletal muscle, adipose cells, vascular endothelial cells and mesenchymal cells, so it is also called these cells mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cell, MSC). The method of inducing differentiation of BMSCs into cartilage is more mature, and is considered to be the most valuable seed cell of cartilage tissue engineering.
【学位授予单位】：华北煤炭医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【参考文献】