维持人胚胎干细胞不分化的鼠饲养层细胞标准化操作的建立与残留的丝裂霉素C对人胚胎干细胞基因组稳定性影响的研究

发布时间：2017-12-29 22:31

本文关键词：维持人胚胎干细胞不分化的鼠饲养层细胞标准化操作的建立与残留的丝裂霉素C对人胚胎干细胞基因组稳定性影响的研究　出处：《中南大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hES cells)是一种从人类早期胚胎的内细胞团中分离出来的多能性干细胞。一方面,它能在体外特定的环境下保持不分化的状态并且无限扩增。另一方面,在特殊的诱导条件下,它又能分化成特定的组织细胞,如神经细胞,胰岛素分泌细胞,心肌细胞和造血细胞等,成为神经退行性疾病,糖尿病,心肌梗塞和血液疾病等疑难疾病的细胞替代治疗的重要细胞来源。上世纪60年代开始到90年代末,小鼠,灵长类等哺乳动物的胚胎干细胞陆续建系成功。在此基础上,1998年,美国Thomson等建立了第一个人胚胎干细胞系,于是,研究开发这种具有巨大临床应用前景的生物资源,立即成为生物医学界最具吸引力的热门领域。但是,由于人胚胎干细胞取自人类早期发育胚胎,因此受到伦理道德方面的质疑,研究也一度受到限制,发展受到制约。2009年初,美国食品药品监督管理部门(Food and drug administration,FDA)批准了第一例利用人胚胎干细胞治疗脊髓损伤的临床治疗试验,随着这一临床治疗试验的获批,人胚胎干细胞的研究将又一次成为生物医学领域新的热潮,而相应的伦理规范也将进一步完善,为胚胎干细胞的研究提供依据与支持。本课题组所在的研究所从2001年开始人胚胎干细胞的建系和培养工作,并于2002年成功建立人胚胎干细胞系。但是在课题研究之初,维持人胚胎干细胞体外培养的环境是很不稳定的,出现大量分化,甚至大量死亡的现象。人胚胎干细胞体外培养的体系较其它细胞严苛和复杂,需要事先制备一层有丝分裂灭活的饲养层细胞作为支持,然后才能进行传代。传代后的培养需每天更换添加了各种因子的培养基,直到六天后下一个传代日的到来再重复上述过程。一般来说,这一层有丝分裂灭活的饲养层细胞是鼠胚胎成纤维细胞,它取材比较方便,不存在伦理学争议,但是操作步骤繁杂,而且这种细胞分裂次数有限,每个批次的细胞用完都必需重新制备。本课题的研究就是从标准化鼠源性饲养层细胞的制备入手,分析造成人胚胎干细胞体外培养环境不稳定的因素,探讨人胚胎干细胞体外培养的安全性问题,为人胚胎干细胞临床应用提供安全稳定的种子细胞。本文共包括两大部分: 第一部分:标准化鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,mEFs)作为饲养层细胞(feeder cells)的操作程序。利用Microsoft office中的Access软件,建立小型管理数据库。第二部分:探讨丝裂霉素C对人胚胎干细胞体外培养的毒性影响。试图揭示人胚胎干细胞体外核型变化以及DNA损伤修复应答缺陷的机制。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【引证文献】