单链脱氧寡核苷酸介导的低密度脂蛋白受体基因点突变小鼠肝脏原位修复研究

发布时间：2017-12-30 00:35

本文关键词：单链脱氧寡核苷酸介导的低密度脂蛋白受体基因点突变小鼠肝脏原位修复研究　出处：《南京医科大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变可导致家族性高胆固醇血症(FH)。修饰的单链脱氧寡核苷酸(MSO)可在基因组的任意位点纠正突变的碱基。本文旨在用反义MSO(A-MSO)对小鼠在体肝细胞中的点突变的LDLR基因进行原位修复研究。方法 1 HepG2细胞LDLR基因无义突变模型原位修复 1.1构建并鉴定LDLR-虫萤光素酶融合蛋白(LDLR-luc)表达载体将野生型(WT)或660突变型(无义突变)LDLR基因连接到虫萤光素酶基因(luc)5'端,构建pWT-LDLR-luc和p660-LDLR-luc。因660-LDLR基因上存在一个C到A的点突变,导致一个无义突变和HinfI酶切位点。DNA测序鉴定质粒。 1.2制备和鉴定HepG2细胞LDLR基因无义突变模型将p660-LDLR-luc瞬时转染HepG2细胞,检测转染后48h HepG2细胞裂解液的虫萤光素酶活性(FLA)以鉴定无义突变模型。 1.3 MSO原位修复HepG2细胞LDLR基因无义突变反义MSO(A-MSO)或正义MSO(S-MSO)可序列特异地置换碱基导致突变修复。A-MSO或S-MSO与p660-LDLR-luc共转染HepG2细胞,转染后72h检测HepG2细胞裂解液的FLA以验证无义突变能否修复,并筛选出较佳的MSO链。 2小鼠在体肝细胞LDLR基因无义突变模型原位修复 2.1验证水动力法的肝靶向性小鼠用水动力法转染pwT-LDLR-luc,检测肝、心、肺、肾和脾组织裂解液的虫萤光素酶活性(FLA),以验证水动力法的肝靶向性。 2.2制备和鉴定小鼠在体肝细胞LDLR基因无义突变模型小鼠用水动力法转染p660-LDLR-luc,检测肝FLA和PCR结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析以鉴定小鼠在体肝细胞LDLR基因无义突变模型。 2.3 MSO肝靶向原位修复小鼠在体肝细胞LDLR基因无义突变小鼠水动力法转染p660-LDLR-luc后12h,以多聚乙烯亚胺(PEI)为载体结合水动力法把MSO输送到小鼠肝脏。给A-MSO 60h后,检测小鼠肝组织裂解液的FLA,以判断无义突变是否修复。 2.4 DNA水平验证无义突变修复 PCR-RFLP和DNA测序以验证LDLR基因无义突变是否修复。结果 1 HepG2细胞实验 1.1 WT-LDLR和660-LDLR的DNA测序结果 p660-LDLR-luc在LDLR基因上存在一个C到A的突变(TGA),pWT-LDLR-luc则否。 1.2虫萤光素酶在HepG2细胞中的表达比较转染不同质粒的HepG2细胞裂解液的FLA。结果显示p660-LDLR-luc组比pWT-LDLR-luc低,但比对照组(转染pWT-LDLR-EGFP)高,差异显著(p＜0.01)。这表明无义突变可能未完全终止虫萤光素酶的表达。 1.3 A-MSO和S-MSO在HepG2细胞中增强p660-LDLR-luc表达虫萤光素酶比较用p660-LDLR-luc和各种MSO共转染的HepG2细胞的FLA,结果显示A-MSO和S-MSO均可明显增强p660-LDLR-luc表达虫萤光素酶,且A-MSO较S-MSO强,差异显著(p＜0.01)。 2小鼠实验 2.1目的质粒靶向小鼠肝脏小鼠水动力法转染pWT-LDLR-luc后72h,检测小鼠肝、心、肺、肾和脾组织裂解液的FLA。结果显示小鼠肝组织FLA较高,而肝外组织几乎检测不到FLA。这表明水动力法转染导致了目的质粒的肝特异性转染。 2.2虫萤光素酶在小鼠肝细胞中的表达及PCR-RFLP结果比较分别转染不同质粒的小鼠在体肝组织裂解液的FLA。结果显示p660-LDLR-luc组比pWT-LDLR-luc组低,但比对照组(转染pEGFP-N1)高,差异显著(p＜0.01)。这表明无义突变在小鼠肝脏可能未完全终止虫萤光素酶的表达。PCR-RFLP分析表明小鼠肝细胞中LDLR基因无义突变未被自动修复。 2.3 A-MSO在小鼠肝细胞中增强p660-LDLR-luc表达虫萤光素酶比较A-MSO组和C-MSO(对照MSO)组的FLA,结果表明A-MSO组的FLA明显高于C-MSO组的FLA(p＜0.01)。 2.4突变碱基A被置换成碱基C PCR-RFLP分析和DNA测序进一步表明LDLR基因上的碱基A被置换成C。结论小鼠水动力法转染p660-LDLR-luc可用于制备小鼠在体肝细胞LDLR基因点突变模型。PEI结合水动力法可使A-MSO有效靶向肝脏。A-MSO可肝内原位修复点突变的LDLR基因。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346

【参考文献】