SNAP29在人类成熟中性粒细胞的表达、亚细胞定位与功能研究

发布时间：2017-12-30 01:22

本文关键词：SNAP29在人类成熟中性粒细胞的表达、亚细胞定位与功能研究　出处：《中南大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 背景与目的人类成熟中性粒细胞(polymorphonuclear nutrophil,PMN)含三级颗粒(tertiary granule,TG)、特异性颗粒(specific granule,SG)、嗜苯胺蓝颗粒(azurophilic granule,AG)与分泌囊泡,在炎症过程中,机体动员胞浆颗粒释放内容物,对机体抗病原微生物感染具有关键意义。胞浆颗粒内容物的释放必须受到严密调控,以便产生有效的抗微生物效应,又避免有害成分释放失控对机体造成过度损伤。因此,胞浆颗粒内容物释放的调控机制成为近年研究的热点。胞浆颗粒释放内容物首先要求颗粒膜锚定于胞浆膜并与之融合,两类膜之间的锚定与融合可能通过颗粒膜与胞浆膜上特定的蛋白来调控的。神经递质的释放即由递质囊泡膜与突触前膜上一类称为可溶性N-己烯顺丁烯二酰亚胺敏感融合因子附着蛋白受体(SolubleN-ethyl-maleimide sensitive factor attachment protein receptor,SNARE)的蛋白调节。在神经元SNARE蛋白中,位于神经递质囊泡膜上的囊泡相关膜蛋白2(vesicle-associated membrane protein 2,VAMP 2)与位于突触前膜上的syntaxin 1A及25kDa的突触小体相关蛋白(25kDasynaptosome-associated protein,SNAP 25)结合成SNARE复合体,调节递质囊泡膜锚定于突触前膜并与之融合。受神经递质释放的调控机制启发,人们亦在PMN内寻找调节胞浆颗粒膜与胞浆膜融合的SNARE蛋白。已于人PMN与髓系白血病细胞株HL60细胞发现许多调节膜融合的SNARE蛋白,包括SNAP-23,-25,syntaxin-1A,-3,-4,-6,-7,-9,-11,VAMP-1,-2,-7等。亚细胞定位研究发现,SNAP-23,-25与VAMP-2位于静息中性粒细胞TG与SG膜;VAMP-1位于静息中性粒细胞TG、SG与AG膜;VAMP-7位于静息中性粒细胞AG膜;syntaxin-4,-6位于静息PMN胞浆膜,并且还发现位于中性粒细胞TG与SG膜上的SNAP 23,VAMP 2与位于胞浆膜上的syntaxin 6,syntaxin 4能形成SNARE复合体,调节PMN胞浆颗粒锚定于胞浆膜,导致膜融合与颗粒内容物释放。然而,PMN胞裂外排的调控机制尚未完全阐明,尤其对AG胞裂外排的机制了解甚少。本实验继续研究可能存在于人类PMN的其他SNARE蛋白及其亚细胞分布,首次发现SNAP 29表达于人类PMN,并分布于中性粒细胞TG与SG膜。至于VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4,因其与SNAP 29组成SNARE复合体,调节PMN胞裂外排(见第二部分),故再次验证其在PMN的表达与亚细胞分布。过去的研究还发现,某些SNARE蛋白(如syntaxin 3与SNAP 23)的编码基因在PMN表达A,B两种亚型,本实验合成新的引物,扩增长片段基因(syntaxin 4)与过去未测序的基因片段(VAMP 1,VAMP 2),并克隆与测序,研究VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4是否表达亚型。方法 (1)采用免疫印迹实验,研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)蛋白在PMN内的表达。 (2)采用基因克隆与测序,研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)基因在PMN内的表达。 (3)用人髓系白血病细胞株HL60细胞做研究模型,研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)蛋白/基因表达于HL60细胞。半定量RT-PCR研究HL60细胞向PMN分化过程中,SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)mRNA表达水平的变化。上述实验为SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)蛋白/基因表达于PMN进一步提供佐证。 (4)PMN去核总蛋白、膜蛋白与胞质溶胶,用免疫印迹分析法研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)是否为膜结合蛋白。 (5)蔗糖密度梯度离心分离PMN(包括静息PMN与PMA活化的PMN)各亚细胞器,分析各亚细胞部分特异性标记物活性(含量)与溶菌酶活性。各亚细胞部分进行免疫印迹实验,研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)蛋白在静息PMN的亚细胞分布。 (6)15-nm金标的抗胞浆颗粒标记物(TG、SG与AG的标记物分别为明胶酶、乳铁蛋白与髓过氧化物酶)抗体标记不同胞浆颗粒,10-nm金标的抗SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)抗体标记SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)阳性颗粒,结合免疫电镜检测术,分析SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)与各胞浆颗粒标记物共存于同一颗粒,进一步研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)蛋白在静息PMN的亚细胞分布。结果 (1)免疫印迹实验表明,SNAP 29(VAMP1,VAMP2与syntaxin4)蛋白表达于人PMN。 (2)基因克隆与测序表明,SNAP 29(VAMP1,VAMP2与syntaxin4)基因表达于人PMN。 Syntaxin4 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,显示两条电泳带,分别为1278与1414 bp,基因测序表明,下带碱基序列与Genbank收录的syntaxin 4基因序列完全一致,而上带为下带碱基序列中插入136个核苷酸的内含子。未发现VAMP 1与VAMP 2基因表达亚型。 (3)SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)蛋白/基因表达于HL60细胞。半定量RT-PCR研究显示,在HL60细胞向PMN分化过程中,SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)mRNA表达水平上调,并于DMSO诱导分化4天后,其表达水平近似于PMN的表达水平,进一步证实了SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)蛋白/基因表达于PMN,并提示SNAP 29蛋白可能是PMN发挥某些生理功能的必需蛋白。 (4)SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)为膜结合蛋白。 (5)①各亚细胞部分特异性标记物活性测定结果显示,第1部分含胞质溶浆;第2、3部分含胞浆膜;第4、5部分含TG;第5、6部分含SG;第7、8部分含AG。 ②溶菌酶活性测定结果显示,溶菌酶主要位于静息PMN第4、5、6、7、8亚细胞部分,即TG、SG与AG。但PMN经PMA活化后,第4、5、6部分溶菌酶活性显著降低,第8部分溶菌酶仍然最高。表明PMA动员TG与SG转位至胞浆膜,但较少动员AG转位。 ③免疫印迹实验结果发现,在静息PMN,SNAP 29位于第4,5,6部分,即TG与SG膜。VAMP 1位于第4,5,6,7,8部分,即TG、SG与AG膜;VAMP 2位于第4,5,6部分,即TG与SG膜;syntaxin 4位于第2,3部分,即胞浆膜。在PMA活化的PMN,SNAP 29从第4,5,6部分转位至第2,3部分,即胞浆膜;位于第4,5,6部分的VAMP 1转位至胞浆膜,而位于第7,8部分的VAMP 1不发生转位;VAMP 2从第4,5,6部分转位至胞浆膜;syntaxin 4仍位于第2,3部分,即胞浆膜。上述结果表明,位于静息中性粒细胞TG与SG膜的SNARE蛋白,在PMN受PMA活化过程中,均转位至胞浆膜,而位于静息中性粒细胞AG膜的SNARE蛋白,在PMN受PMA活化过程中不发生转位,与PMA动员TG与SG,但不动员AG至胞浆膜高度相关,故进一步佐证SNAP 29,VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4的亚细胞分布。 (6)胶体金双标胞浆颗粒结合免疫电镜检测结果表明,SNAP 29位于TG与SG膜。VAMP 1位于TG、SG与AG膜;VAMP 2位于TG与SG膜;syntaxin 4位于胞浆膜。结论 (1)SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)蛋白表达于人PMN。 (2)SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4)基因表达于人PMN。 syntaxin 4除表达Genbank收录的基因外,还表达一个基因亚型,其中插入有136个碱基的内含子。未发现VAMP 1与VAMP 2表达亚型。 (3)SNAP 29位于静息中性粒细胞TG与SG膜。VAMP 1位于TG、SG与AG膜;VAMP 2位于TG与SG膜;syntaxin 4位于胞浆膜。第二部分两个SNARE复合体,SNAP29/VAMP1/syntaxin4与SNAP29/VAMP2/syntaxin4,调节中性粒细胞三级颗粒与特异性颗粒胞裂外排背景与目的人类中性粒细胞(polymorphonuclear nutrophil,PMN)含三级颗粒(tertiary granule,TG)、特异性颗粒(specific granule,SG)、嗜苯胺蓝颗粒(azurophilic granule,AG)与分泌囊泡,不同颗粒被动员的难易程度存在显著差异,其中TG与SG易于动员,一旦PMN活化即发生胞裂外排,调节PMN的粘附、渗出与杀微生物效应;AG(含大量溶解酶与杀菌蛋白)最不易被动员,其胞裂外排常发生于对吞噬小体的处理过程中。PMN不同胞浆颗粒被动员的难易程度不同,提示机体存在某种机制,对PMN不同颗粒的分泌进行精确调控。在研究神经递质释放机制过程中,提出了SNARE(SolubleN-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor)假说,该假说认为,位于神经递质囊泡膜上的囊泡相关膜蛋白2(vesicle-associatedmembrane protein 2,VAMP 2)与位于突触前膜上的syntaxin1A及分子量为25kDa的突触小体相关蛋白(25 kDa synaptosome-associatedprotein,SNAP 25)具有共同的约60个氨基酸的同源基序,在神经递质分泌过程中,同源基序紧密结合成SNARE复合体,使囊泡与突触前膜相互靠近并融合。SNARE复合体由四个α螺旋束组成,其中VAMP 2与syntaxin 4各提供一个α螺旋,SNAP 25提供两个α螺旋。所有已知的SNARE基序根据其中心位点氨基酸种类不同分为两个亚家族:即Q-SNARE基序(中心位点为保守的谷氨酰胺残基)与R-SNARE基序(中心位点为保守的精氨酸残基)。神经元的SNARE复合体包含三个Q-SNARE基序(syntaxin 1A提供一个,SNAP 25提供两个)与一个R-SNARE基序(VAMP 2提供),形成3(Q-SNARE)/1(R.SNARE)模式。 SNARE蛋白也是PMN分泌过程中的调节蛋白,3(Q-SNARE)/1(R-SNARE)似乎是所有调节膜融合的SNARE复合体的结构范式。根据SNARE假说,PMN胞浆颗粒膜上的SNARE蛋白只能与胞浆膜上与之同源的SNARE蛋白结合,形成3(Q-SNARE)/1(R-SNARE)结构的SNARE复合体,使胞浆颗粒锚定于胞浆膜并与之融合。不同颗粒膜上SNARE蛋白的种类与密度不同,可能是PMN不同颗粒发生胞裂外排难易程度存在差异的原因。已首次发现SNAP 29表达于PMN,并位于静息中性粒细胞TG与SG膜(见第一部分)。亦已知VAMP 1(位于TG、SG与AG膜),VAMP 2(TG与SG膜)与syntaxin 4(位于胞浆膜)等其他SNARE蛋白表达于PMN。本实验旨在研究SNAP 29是否在PMN胞裂外排过程中发挥调节功能,以及研究与SNAP 29结合成SNARE复合体的其他SNARE蛋白及其组合模式。方法 (1)制备电通透的PMN,孵育不同剂量的抗SNAP 29抗体,然后用Ca~(2+)+GTP-γ-S活化电通透的PMN,多聚甲醛固定,用抗CD66b(TG与SG的特异性标志分子)或抗CD63(AG特异性标志分子)的抗体孵育细胞,再孵育FITC偶联的荧光二抗,流式细胞术检测抗SNAP 29抗体对细胞活化引起的细胞表面CD66b或CD63上调的抑制效应,研究SNAP 29是否调节TG、SG与AG分泌。同上制备电通透的PMN,用抗VAMP 1,抗VAMP 2或抗syntaxin4抗体孵育,研究VAMP 1,VAMP 2,或syntaxin 4是否调节TG、SG与AG分泌。 (2)联合应用抗SNAP 29与其他抗体(抗VAMP 1,抗VAMP 2或抗syntaxin 4抗体)孵育电通透的PMN,研究两种抗体对细胞活化引起的细胞表面CD66b或CD63上调的协同抑制效应,并推断SNAP29在调节胞浆颗粒分泌过程中可能形成的SNARE复合体。 (3)免疫共沉淀研究PMN胞浆颗粒分泌过程中可能形成的SNARE复合体。经PMA活化的PMN制备蛋白溶浆,用预先结合有抗SNAP 29抗体的protein A-Sepharose免疫沉淀PMN活化过程中可能形成的含SNAP 29的SNARE复合体。免疫沉淀物用于免疫印迹实验,用抗VAMP 1,抗VAMP 2或抗syntaxin 4等抗体探测SNAP 29的同源SNARE蛋白。同理,分别研究VAMP 1,VAMP 2或syntaxin 4的同源SNARE蛋白。结果 (1)抗SNAP 29与抗VAMP 2均剂量依赖性抑制PMN活化引起的细胞表面CD66b上调,但两者均不抑制CD63上调,表明SNAP29与VAMP 2均调节TG与SG分泌,但均不调节AG分泌。抗VAMP 1与抗syntaxin 4均剂量依赖性抑制CD66b与CD63上调,表明VAMP 1与syntaxin 4均调节TG、SG与AG分泌。 (2)联合应用抗SNAP 29与抗VAMP 1,协同抑制CD66b上调,但对CD63上调的抑制效应,与单用VAMP 1相同,表明SNAP 29可能与TG及SG上的VAMP 1形成SNARE复合体,调节TG与SG分泌,但AG的分泌受VAMP 1调节,而不受SNAP 29调节。联合应用抗SNAP 29与抗VAMP 2,协同抑制CD66b上调,但不抑制CD63上调,表明SNAP 29与VAMP 2可能形成SNARE复合体,调节TG与SG分泌,但两者均不调节AG分泌。联合应用抗SNAP29与抗syntaxin4,协同抑制CD66b上调,但对CD63上调的抑制效应,与单用syntaxin 4相同,表明SNAP29与syntaxin 4可能形成SNARE复合体,调节TG与SG分泌,但AG的分泌受syntaxin 4调节,而不受SNAP 29调节。联合应用抗VAMP 1与抗syntaxin 4,协同抑制CD66b与CD63上调,表明TG及SG上的VAMP 1,可能与胞浆膜上的syntaxin4相互作用形成SNARE复合体,调节TG与SG分泌;位于AG上的VAMP1与位于胞浆膜的syntaxin 4亦可能形成SNARE复合体,调节AG分泌。联合应用抗VAMP 2与抗syntaxin 4,协同抑制CD66b上调,但对CD63上调的抑制效应,与单用syntaxin 4相同,表明VAMP 2与syntaxin 4可能形成SNARE复合体,调节TG与SG分泌,但AG分泌受syntaxin 4调节,而不受VAMP 2调节。综合抗体联合抑制实验结果,SNAP 29可能形成两个SNARE复合体,即:SNAP 29/VAMP 1/syntaxin 4与SNAP 29/VAMP 2/syntaxin 4,调节中性粒细胞TG与SG胞裂外排;VAMP 1与syntaxin4亦可能形成SNARE复合体,调节AG分泌。 (3)免疫共沉淀实验结果显示,PMA(动员TG与SG)活化的PMN蛋白溶浆,抗SNAP 29抗体能免疫沉淀VAMP 1,VAMP 2与syntaxin4,表明SNAP 29能与VAMP 1,VAMP 2和syntaxin 4中任一蛋白形成SNARE复合体,调节TG与SG胞裂外排。抗VAMP 2抗体能免疫沉淀SNAP 29与syntaxin 4,但不能免疫沉淀VAMP 1,表明VAMP 2能与SNAP 29和syntaxin 4中任一蛋白形成SNARE复合体,调节TG与SG胞裂外排,但VAMP 2与VAMP1不形成SNARE复合体。抗syntaxin 4抗体能免疫沉淀SNAP 29,VAMP 1与VAMP 2,表明syntaxin 4能与SNAP 29,VAMP 1和VAMP 2中任一蛋白形成SNARE复合体,调节TG与SG胞裂外排。 fMLP(动员TG、SG与AG)活化的PMN蛋白溶浆,抗syntaxin 4抗体能免疫沉淀SNAP 29,VAMP 1与VAMP 2,且沉淀VAMP 1的量,显著多于PMA(动员TG与SG)活化的PMN蛋白溶浆中沉淀的VAMP 1的量,表明syntaxin 4不仅与TG及SG上的VAMP 1形成SNARE复合体,调节TG与SG分泌,而且与AG上的VAMP 1形成SNARE复合体,调节AG分泌(见正文附图)。综合免疫共沉淀实验结果,SNAP 29可能形成两个SNARE复合体,即:SNAP 29/VAMP 1/syntaxin 4与SNAP 29/VAMP 2/syntaxin4,调节TG与SG分泌。VAMP 1与syntaxin 4亦可能形成SNARE复合体,调节AG分泌。VAMP 1与VAMP 2不共存于同一个SNARE复合体。结论 (1)SNAP 29,VAMP 1,VAMP 2与syntaxin 4皆调节PMN胞浆颗粒分泌。 (2)SNAP 29与VAMP 2调节TG与SG分泌;VAMP 1与syntaxin4调节TG、SG与AG分泌。 (3)两个SNARE复合体,SNAP 29/VAMP 1/syntaxin 4与SNAP 29/VAMP 2/syntaxin 4,调节TG与SG分泌。VAMP 1与syntaxin 4形成SNARE复合体,调节AG分泌。VAMP 1与VAMP 2不共存于同一SNARE复合体。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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