DNA脱甲基化对整合至rDNA区外源基因hFⅧ表达量的影响

发布时间：2017-12-30 02:32

本文关键词：DNA脱甲基化对整合至rDNA区外源基因hFⅧ表达量的影响　出处：《中南大学》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： DNA甲基化作为一种基因表达调节机制,在许多生物学过程中扮演着重要的角色,包括胚胎发育、遗传印记、细胞分化和肿瘤发生等。pHrneo是被我室构建的一种人类核糖体DNA打靶载体。它能靶向外源基因到人类核糖体DNA区。由pHrneo携带的外源基因能稳定地在多种细胞中表达,包括HL7702(人类肝细胞)和HT1080(人类纤维肉瘤细胞),但是,其表达效率有待于进一步提高。影响定点整合目的基因表达的因素可能有多种,包括目的基因的拷贝数、DNA甲基化修饰、组蛋白的乙酰化修饰等。这里我们从DNA甲基化修饰的角度,探究其对定点整合目的基因表达的影响。目的:通过比较脱甲基化药物5-aza-2'-deoxycytidine处理组和对照组定点整合克隆细胞株目的基因人凝血因子Ⅷ的表达情况,以及目的基因CMV启动子区甲基化情况,研究DNA甲基化对目的基因表达的影响。方法:我们选择三种不同浓度的脱甲基化药物5-aza-2'-deoxycitidine-5μM、10μM、20μM,分别对pHrneoSK39-25细胞株处理72小时和120小时,同时以未加脱甲基化药物处理的定点整合克隆细胞株、脱甲基化药物处理的HT1080细胞株和相同条件下未处理细胞的同浓度的脱甲基化药物为对照组。收集各组细胞上清,通过ELISA检测各组hFⅧ的表达情况。此外,用重亚硫酸盐测序PCR,确定CMV启动子区的甲基化状态。结果:ELISA检测各组目的基因表达情况显示,用5-aza-2'-deoxycytidine处理72小时和120小时的细胞,hFⅧ的表达量分别是未加脱甲基化药物处理对照组的5倍和10倍。重亚硫酸盐测序PCR的结果显示目的基因CMV启动子区未发现有甲基化位点。结论:DNA甲基化修饰对定点整合目的基因的表达有较大影响,但是这种影响可能并非由目的基因启动子区异常甲基化引起的。我们推测rDNA区脱甲基化引起染色质结构变化可能是造成这一结果的原因。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346

【参考文献】