人类γδT细胞抗原表位肽的鉴定和健康人γδT细胞克隆的建立及鉴定

发布时间：2017-12-30 08:23

本文关键词：人类γδT细胞抗原表位肽的鉴定和健康人γδT细胞克隆的建立及鉴定　出处：《中国协和医科大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 尽管γδT细胞在机体抗感染、抗肿瘤的固有免疫应答中发挥重要的作用,但是目前所发现的配体抗原仅限于十余种,根本无法与承担特异性细胞免疫应答的αβT细胞可识别数以亿万计的抗原表位肽相比。此外,有关γδT细胞的表位蛋白多肽则尚无报道。因此,有必要进行γδT细胞蛋白抗原表位肽的研究,以澄清活化γδT细胞的结构基础。另一方面,活化的γδT细胞是机体免疫系统内杀伤肿瘤细胞的重要效应细胞,一旦获得具有活化γδT细胞的抗原表位多肽,可为体内外激活γδT细胞提供一个有效的活化手段。为此,我们所关注的第一个科学问题是是否存在人类γδT细胞的抗原表位?如果存在,多个串联抗原表位多肽是否比单个抗原表位肽更具刺激γδT细胞的能力?围绕上述两个科学问题我们开展了人类γδT细胞的抗原表位肽的鉴定研究。我们实验室先前根据三个来源于卵巢癌组织浸润的γδT细胞的TCRδ链互补决定区(CDR)3的(CDR3δ)基因序列,合成了三条CDR3δ多肽OT1、OT2、OT3,并且以这三条多肽为探针,在噬菌体随机十二肽库中筛选与CDR3δ多肽结合的十二肽,作为γδT细胞的候选抗原表位肽。我们获得了7个能与探针特异性结合的候选抗原表位肽。体外实验表明,这些多肽能在一定程度上增强γδT细胞杀伤肿瘤细胞的能力,提示这些多肽具有抗原表位活性。但是,可能由于这些多肽分子量小,因此,它们对γδT细胞的活化能力较弱。为了增强这些潜在抗原表位肽激活γδT细胞的能力,我们试图通过制备串联抗原多肽的方式来提高其刺激活性。具体的实验思路为:通过分子克隆技术,将表位肽串联,并与无关载体蛋白GST连接构建GST-表位融合蛋白表达载体,表达并鉴定了这些GST-表位融合蛋白的功能,以进一步阐明该项策略的可行性。这一研究的主要工作及其结果如下: 首先,我们通过流式细胞仪检测、~3H掺入法、MTT掺入法证实筛选到的十二肽能在一定程度上刺激γδT细胞增殖并增强其杀伤肿瘤的作用,提示这些十二肽可能是γδTCR特异性识别的抗原表位肽。这为进一步澄清活化γδT细胞的结构基础提供了依据。其次,采用同尾酶技术构建了含不同表位组合方式的GST-表位融合蛋白的表达载体,通过ELISA和流式细胞术检测,从分子水平和细胞水平证实这些原核表达的重组GST-表位融合蛋白能与探针OT3、OT3(V)-Fc分子及γδT细胞的TCR特异性结合。并且,利用CFSE染色和MTT掺入的方法,验证GST-表位融合蛋白可刺激γδT细胞群体的增殖作用。此外,GST-表位融合蛋白与γδT细胞孵育后,发现它们可以促进γδT细胞的杀伤作用,且GST-串联表位融合蛋白的作用要强于GST-单表位融合蛋白。通过半定量RT-PCR和进一步的ELISA定量分析,发现GST-表位融合蛋白能够促进γδT细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ,和TNF-α;此外,Fas配体和颗粒酶B的表达也有所增加。最后,我们观察了GST-串联表位融合蛋白刺激的人γδT细胞对荷瘤裸鼠的抑瘤作用。结果显示,GST-串联表位融合蛋白刺激的人γδT细胞治疗组小鼠肿瘤的生长较未刺激γδT细胞治疗组相比明显受到抑制,小鼠的生存期也有所延长。综上,我们首次系统地验证了γδT细胞表位肽的存在。这些表位肽能在一定程度上刺激γδT细胞增殖,并增强其杀伤肿瘤的作用。其次,通过构建GST-表位融合蛋白并进行功能实验证实,串联表位肽的γδT细胞活化效果要优于单表位肽。这说明将表位串联起来提高表位的γδT细胞活化能力的新策略是完全可行的。这将为基于γδT细胞的过继免疫细胞治疗肿瘤提供新型活化手段。 γδT细胞是一群特殊的T细胞,是连接固有免疫和特异性免疫之间不可或缺的桥梁。由于γδT细胞在外周血中只占很少的比例,分离纯化相对较繁琐,这为深入研究γδT细胞的结构和功能带来了一定的困难。因此,若能建立在体外可长期培养的γδT细胞克隆,尤其是建立单个的γδT细胞克隆,将极大地促进其抗原识别、细胞活化及功能等研究。为此,本文的第二方面工作为健康人γδT细胞克隆的建立及鉴定。在本实验中,我们首先探索了固相法扩增的γδT细胞的冻存与复苏条件。其次,以~(60)Co照射的同种异体PBMC作为饲养细胞,以有限稀释法对经过阳性分选的γδT细胞进行克隆化。用流式细胞术及分子生物学检测鉴定所获克隆,以MTT掺入法对所获克隆进行细胞毒检测。结果共获得五株γδT细胞克隆,这五株克隆均为Vγ9Vδ2亚型,CD4分子和CD8分子表达均为阴性,对肿瘤细胞SKOV3均具有一定的杀伤作用。在这5株γδT细胞克隆中,有两株为单克隆,且这两株单克隆经证实为相同克隆,其VδCDR3区序列为ACDTIPGDLVRADKLIFGKG,VγCDR3区序列为ALWEVGKLGKKIKVFGPG。另三株克隆为寡克隆,其中有两株为双克隆,另一株为三克隆。这五株γδT细胞克隆的相关功能实验正在进行之中。综上,本实验第二部分建立了正常人外周血γδT细胞克隆,为深入研究γδT细胞结构、表面标志、亚群及功能奠定了坚实的基础。
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【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

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