Ferritin-L和SCCA1作为HBV共受体的研究

发布时间：2017-12-30 09:21

本文关键词：Ferritin-L和SCCA1作为HBV共受体的研究　出处：《复旦大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：病毒受体是位于宿主细胞表面的分子复合物,能够被病毒识别,并帮助病毒进入宿主细胞。从现在已经发现的病毒受体来看,大部分病毒受体是蛋白质,还有些是蛋白聚糖、脂类或糖脂,既有单体状态也有多聚体的形式存在。由于宿主细胞表面的病毒受体的存在,使得病毒具有特异性、高亲和性等等生物学特征。病毒受体是引起病毒感染的主要原因,也是影响病毒组织嗜性的重要因素。随着生命科学的研究手段的不断发展,病毒受体的研究也取得的大量的成就,越来越多的病毒受体被确定。并且人们发现某些病毒为了能够进一步的快速有效的侵染靶细胞,常常利用一个以上的受体。研究这些受体、共受体的特性及其功能,对于从分子水平阐明病毒侵染的机制,研制有效的药物、疫苗等都具有重要的意义。由于没有便捷的感染模型,乙肝病毒(HBV)受体相关研究一直进展缓慢。虽然有很多相关的报道发现许多能够与HBV的preS蛋白发生相互作用的蛋白质,但都没有实质性证据支持这些蛋白质在HBV感染中的具体作用。2001年意大利的一个研究小组报道了SCCA1 (也称HBV binding protain, HBV-BP)可以和HBV的表面抗原蛋白preS1(21-47)发生相互作用。当将其转染入HepG2(肝癌细胞)和CHO(仓鼠卵巢细胞)细胞进行过表达后,都能有效地提高细胞对HBV吸附的能力。不过CHO虽然对HBV的感染能力的提高,与HepG2细胞相比却有数量级的差距。这现象表明HepG2细胞表面可能存在另外一个HBV的共受体,并且由于它的存在使得HepG2细胞在过量表达SCCA1后拥有了比CHO细胞更强的吸附和感染HBV的能力。本博士论文基于SCCA1在CHO和HepG2细胞中的过表达所带来的对HBV的吸附能力上的差异,展开了对潜在的HBV的共受体的寻找。在第一章中,利用细菌双杂交方法,分别以HBV的preS和SCCA1为诱饵蛋白,在正常人肝脏的cDNA文库筛选同时与preS和SCCA1发生相互作用的蛋白质。以preS为诱饵蛋白,筛选得到了101个与其发生相互作用的阳性克隆；使用SCCA1为诱饵蛋白,筛选得到了91个阳性克隆。通过测序并比对这些克隆的序列,我们发现ferritin light chain(ferritin-L)同时出现在了这两组阳性克隆中。因此我们将ferritin-L这个在细菌双杂交系统中能和preS与SCCA1发生相互作用的蛋白质作为生化和细胞学研究的对象。在第二章中,我们利用了生物化学手段对ferritin-L与preS和SCCA1的相互作用进行了进一步验证。首先,构建了并在大肠杆菌中进行表达preS、ferritin-L和SCCA1的重组蛋白,通过pull down的方法验证了这三者中两两之间可以发生相互作用。其次,在大肠杆菌中表达了一系列的preS和ferritin-L缺失突变的融合蛋白,通过pull down实验发现了preS, ferritin-L和SCCA1这三者之间两两相互作用的区域各不相同,这样就为三者形成共同的复合物提供了可能性。最后,我们将preS、ferritin-L和SCCA1三者同时进行了pull-down,结果显示这三个蛋白质在体外可以形成复合物。如果ferritin-L是与SCCA1结伴的HBV共受体,那么必须满足促进HBV吸附宿主细胞的条件。在本博士论文的第三章中,在细胞水平进一步验证了preS、ferritin-L和SCCA1三种蛋白质之间的相互作用。首先构建的ferritin-L和SCCAl与荧光蛋白的融合表达载体,利用共聚焦显微镜观察到ferritin-L和SCCA1在细胞中的分布状况,发现有相当多的重叠,表明在细胞中完全有可能发生ferritin-L与SCCA1的聚合。在肝癌细胞株SMMC-7721(肝癌细胞)和CHO细胞中共转染SCCA1和ferritin-L的表达质粒,发现共表达SCCA1和ferritin-L的细胞对HBV的吸附能力比单独表达SCCA1有了显著的提高。如果在培养基中加入大肠杆菌表达的外源ferritin-L,7721细胞对于HBV的吸附能力有了剂量依赖型的下降。综上所述,本博士论文工作利用细菌双杂交的手段筛选到了能与preS和SCCA1同时发生相互作用的蛋白质——ferritin-L,并使用生物化学和细胞生物学的方法验证这三者之间可以形成聚合体,ferritin-L和SCCA1可能是一对HBV的共受体。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392.1

【参考文献】