鉴定分析与BMP9诱导成骨有关的TGFβ受体

发布时间：2017-12-31 07:18

  本文关键词：鉴定分析与BMP9诱导成骨有关的TGFβ受体　出处：《重庆医科大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)是转化生长因子β(Transforming growth factorβ, TGFβ)超家族的成员之一,最初因为其能诱导骨和软骨的形成而得名,目前认为,BMPs与系统发育中的细胞增殖和分化有关,BMPs可以调控间充质干细胞向骨、软骨、肌腱和脂肪分化。至今共分离和鉴定了20余种BMPs,主要已报道的具有诱导成骨活性的BMPs为BMP2、5、7等,其中BMP2和BMP7已经被用于临床治疗,但在临床实际应用上效果还不能令人满意。因此,寻找更强的诱导细胞成骨分化的细胞因子成为目前共同关注的课题,也是临床的迫切需要。 在实验室的前期研究工作中,我们通过重组腺病毒介导的方法,系统研究了BMP2～BMP15共14种BMPs在诱导骨形成中的的作用。采用间充质干细胞C3H10细胞系,分别在体外和裸鼠体内进行研究。发现除传统BMP2、7外,BMP4、6、9也具有诱导成骨作用,其中BMP9诱导间充质干细胞C3H10成骨的作用,远强于传统应用的BMP2和BMP7。BMP9是目前已知的BMPs(包括BMP2、BMP7)中诱导成骨能力最强的因子,有希望作为一种更强的促进细胞成骨分化的细胞因子替代品,因此具有广阔的潜在的临床应用价值。 但是,BMP9诱导成骨的机制目前并不十分清楚。作为TGFβ家族成员,所有的BMPs(包括BMP9)都主要通过TGFβ信号转导通路传递信号,发挥其诱导成骨的功能。首先BMPs与具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的跨膜TGFβⅡ型和Ⅰ型受体结合,启动信号转导,随后,磷酸化的Ⅰ型受体激活转录因子Smads,由激活的Smads调控细胞核内相关基因的表达。因此,在BMPs信号转导过程中,TGFβ受体起着承上(与BMPs结合)和启下(活化Smads)的作用,是BMPs信号转导的关键节点,是BMPs早期信号转导的最重要的分子之一,与BMPs发挥诱导成骨的活性关系密切。BMP2和BMP7等成骨性BMPs,其相关的TGFβ受体已经被鉴定和分析清楚,但是与BMP9诱导成骨有关的TGFβ受体,目前了解很少,这也限制了对于BMP9诱导成骨机制的揭示。 基于以上分析,本研究综合应用分子生物学、细胞生物学、实验动物学等多项技术,如细胞培养、基因克隆、基因转染、重组腺病毒、细胞分化实验技术、real time PCR、动物模型、Micro-CT、组织化学染色等,主要鉴定分析与BMP9诱导成骨有关的TGFβ受体,为BMP9诱导成骨的机制,在受体水平上提供证据。整个研究分为两大部分,主要研究结果如下: 第一部分研究中,我们分析已知的七种TGFβⅠ型受体和四种TGFβⅡ型受体的核苷酸序列,PCR扩增含受体胞外结构域和跨膜结构域部分的片段,并将片段克隆入腺病毒穿梭质粒载体pAdtrace-TO4,通过菌落PCR、限制性内切酶酶切和DNA序列测定对阳性克隆进行鉴定,得到共11种TGFβ受体相应的显性负性突变体(dn-receptor)质粒;随后,在BJAdeasy细菌中同源重组dn-receptor腺病毒质粒,重组dn-receptor腺病毒质粒转染293细胞,使腺病毒在其中包装和扩增,最后得到11种dn-receptor重组腺病毒。将制备的dn-receptor腺病毒感染目标细胞C3H10,在感染24小时后,荧光显微镜观察发现11种dn-receptor腺病毒均可在C3H10内表达RFP红色荧光蛋白,产生红色荧光;在病毒感染C3H10细胞48小时后,提取细胞RNA,经过逆转录制备cDNA,PCR扩增,结果显示,所有11种dn-receptor均可在C3H10细胞内表达。通过这部分实验,我们最终获得了11种TGFβ受体相应的显性负性突变体腺病毒,并验证了其在细胞内的表达。显性负性突变的TGFβ受体可以与细胞内的野生型受体竞争相应配体,抑制配体功能的发挥。该部分制备的腺病毒用于第二部分实验,而且也可以用于TGFβ信号通路中与TGFβ受体有关的相关研究。 第二部分研究中,首先在体外实验中,我们利用显性负性突变型TGFβ受体腺病毒和BMP9共同作用间充质干细胞C3H10、骨髓基质细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)和鼠成肌细胞C2C12,通过ALP定性和定量试验以及荧光素酶报告基因试验,初步筛选出了5种dn-receptor可以抑制BMP9诱导的ALP和荧光素酶活性,它们分别是dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB;进一步研究发现,它们对于ALP表达的抑制存在剂量依赖性,而且还可以抑制C3H10和MEFs细胞的钙盐沉积,抑制细胞的成骨分化;通过Real-time PCR发现dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB这5dn-receptor可以抑制BMP9靶基因(Smad6,Smad7和Id1)的表达。将dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB和BMP9共感染C3H10细胞,在裸鼠皮下进行注射,5周后观察并剥离皮下包块,Micro-CT扫描和影像重建;石蜡包埋、切片,组织化学染色观察包块内细胞成骨情况,结果显示与对照相比,dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB处理组成骨包块偏小,而且其包块内成骨不活跃,表明dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB可以抑制BMP9诱导的C3H10在裸鼠皮下的成骨。从以上结果看这五种dn-recepotr相应的野生型受体(ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ和ActRⅡB)很可能与BMP9诱导成骨有关。因此,我们利用pSOS系统筛选了能抑制相应受体表达的siRNA(首先测试了ALK1和ALK2),再利用RNAi抑制ALK1和ALK2的表达,发现抑制ALK1和ALK2表达后,BMP9诱导的荧光素酶活性可相应被抑制。 综上所述,本研究从细胞水平到动物整体水平,全面鉴定分析了可能与BMP9诱导成骨有关的TGFβ受体,从整个研究中我们得到以下研究结论: 1. TGFβ受体与BMP9诱导成骨活性密切相关,相应dn-receptor可以抑制BMP9诱导的细胞成骨分化。 2.构建和制备的dn-receptor腺病毒可以有效地在目标细胞中表达相应的dn-recepotr,因此,它们不但可以用于BMP9相关TGFβ受体的研究和分析,也可以用于TGFβ家族其它分子的研究(如BMP13, BMP14,它们对于软骨形成有重要作用,其相关的TGFβ受体未知)。 3通过测试C3H10、BMSC、MEFs和C2C12四种细胞发现:在7种Ⅰ型dn-receptor中,dnALK1和dnALK2能有效抑制BMP9诱导的荧光素酶活性和早期成骨指标ALP活性;在4种Ⅱ型dn-receptor中,dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ、dnActRⅡB可以有效抑制BMP9诱导的荧光素酶活性和ALP活性,而且这种抑制作用具有剂量依赖性。 4.进一步研究证实,dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ、dnActRⅡB可以有效抑制BMP9诱导的钙盐沉积,并且可抑制BMP9调控的相关靶基因基因(Smad6,Smad7,Id1)的表达。因此,在11种TGFβ受体中,ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB可能与BMP9诱导成骨有关。 5.通过pSOS系统筛选了能有效抑制ALK1、ALK2表达的小分子干扰RNA(siRNA),发现在利用RNA干扰(RNAi)技术抑制C3H10细胞种ALK1、ALK2表达后,继而可抑制BMP9诱导的荧光素酶活性,初步显示在抑制目标细胞相关TGFβ受体表达后,BMP9成骨活性受到了抑制。这提示,继续研究细胞内ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB等受体表达抑制后,对于BMP9诱导成骨效应的影响,将有助于阐明BMP9诱导成骨的机制。
[Abstract]:Bone morphogenetic protein ( BMPs ) is one of the members of transforming growth factor - 尾 ( TGF - 尾 ) superfamily . The BMPs can regulate the proliferation and differentiation of bone and cartilage . BMPs can regulate the proliferation and differentiation of bone , cartilage , tendon and fat . BMP2 and BMP7 , BMP2 and BMP7 , were used to induce bone formation in vitro and in nude mice . BMPs ( BMPs ) and BMP7 ( BMPs ) are the most important molecules in BMPs signal transduction . Based on the above analysis , this study comprehensively applied several techniques , such as cell culture , gene cloning , gene transfection , recombinant adenovirus , cell differentiation experiment , real time PCR , animal model , Micro - CT , histochemical staining , etc . In the first part , we analyzed the nucleotide sequences of seven types of TGF - 尾 type 鈪，

本文编号：1358722