脱矿牙本质基质骨诱导性及相关细胞鉴定的实验研究

发布时间：2018-01-01 20:19

  本文关键词：脱矿牙本质基质骨诱导性及相关细胞鉴定的实验研究　出处：《昆明医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的： 通过对DDM诱导成骨过程中各种细胞演变过程的观察和对间充质干细胞、成骨细胞和软骨细胞的进行免疫组化鉴定,TRAP染色对破骨细胞进行观察,探讨DDM诱导成骨机制的细胞理论框架和成骨方式。 方法； 采用自身对照的研究方法在24只3月龄新西兰大耳白兔双侧竖脊肌区制备标准一致的四个肌袋位点,随机选取三个位点为实验位点,植入DDM50mg (湿重,下同),另一位点为对照位点,空白对照,不植入任何材料。分别于术后1周、2周、3周、4周、8周、12周、16周和20周处死动物获取组织标本,应用HE染色、TRAP染色和免疫组织化学染色对间充质干细胞、成骨细胞、软骨细胞及破骨细胞的鉴定。采用Image-Pro(?) Plus6.0图像分析软件测量组织切片累积光密度值(IOD),对间充质干细胞、成骨细胞、软骨细胞进行分析。所有数据用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。 结果： 1.大体观察 术后所有动物完全苏醒,精神状态良好,活动自如,正常饮食；创口未见开裂,无红肿、出血及渗出。术后第三天,创口已部分愈合,部分缝线被兔咬断。 术后一周,术区毛发逐渐生长,部分已覆盖愈合的创口,所有动物精神状况良好,饮食、活动正常。 获取组织标本时,随时间的增加,可见DDM与肌肉组织紧密融合；所有标本均未见DDM周围组织红肿、化脓等现象。 2.组织学观察 (1)HE染色 对照组中,见肌纤维并行排列,肌纤维之间有细胞核位于胞质的周边,呈梭形；第一周至二十周的组织切片中,肌肉组织中均未见有炎性细胞侵入。实验1周组,见DDM与周围组织贴附,部分可见贴附不紧密,有间隙；细胞呈环形包绕DDM周围,可见肉芽组织、小血管、炎性细胞、梭形的成纤维细胞和多核巨细胞。2周组,细胞紧密贴附DDM,周围组织细胞数量减少,可见嗜碱性细胞。3周组,DDM间组织可见条索状形成,可见团状淡蓝色软骨样基质、均质红染的软骨样基质和呈立方状的成骨样细胞。4周组,DDM周围可见均质红染的骨样基质,立方状的成骨样细胞被覆基质表面。8周组,DDM颗粒边缘见重新矿化,呈紫蓝色,边缘可见吸收凹陷,细胞贴附；有骨样基质形成,表面有立方状成骨样细胞,外围有嗜酸性细胞。12周组和16周组,DDM之间可见空泡状脂肪细胞,团状无孔均质红染骨样组织,边缘有立方状成骨样细胞被覆,血管出现,其内见双凹状红细胞。20周组,DDM周围组织中可见软骨样基质,成骨样细胞被覆表面,DDM可见矿化区,呈紫蓝色,外周有一层成纤维细胞形成膜状结构。 (2)免疫组化染色和TRAP染色 1)CD44免疫组化染色 实验组CD44阳性表达第一周可见在DDM周围的组织中,并未紧贴DDM,然后逐渐靠近DDM,表达逐渐增强,至第四周达高峰,而第四周至第二十周,阳性表达逐渐减弱,说明间充质干细胞由周围组织逐渐向DDM聚集。方差分析：第一周与第二、三、四、八、十二周,第二周与第一、三、四、二十周,第三周与第一、二、四、八、十六、二十周,第四周与各时间点,第八周与第十六、二十周之间,差异有统计学意义(P0.05)。而对照组均无阳性表达。 2)ALP免疫组化染色(碱性磷酸酶免疫组化) 实验组中ALP阳性表达部位靠近DDM,逐渐向外围扩展。ALP表达的数量由第一周逐渐增强,至第四周达到峰值,而第四周后,阳性表达逐渐降低。说明成骨细胞开始由DDM边缘开始,逐步向外围生长成熟,第四周后成骨细胞的数量开始逐渐减少。方差分析：第一周与第三、四、八周,第二周与第三、四、十六、二十周,第三、四周与各时间点,第八周与第十六、二十周之间,差异有统计学意义(P0.05)。而对照组均无阳性表达。 3)Ⅱ胶原免疫组化染色 实验组第一周可见DDM周围有Ⅱ胶原阳性表达,并逐渐增多,第四周阳性表达略有减低,第八周时达到顶峰,此后略有减低,但未随时间的增加而出现明显减少；对照组无阳性表达。方差分析：第一周与其他各时间点之间,第二周与第八周,第四周与第八周,第八周与第二十周之间,两两比较差异有统计学意义(P0.05)。而对照组均无阳性表达。 4) TRAP染色(抗酒石酸酸性磷酸酶染色) 阳性对照可见酶活性部位呈红橙色,分布于胞质内,细胞核为阴性。空白对照和实验组中均未见阳性表达,说明在本实验观察周期内无破骨细胞生成。 结论： 1、DDM植入兔竖脊肌袋,在观察周期内,无组织炎症、免疫排异和坏死,表明DDM具有良好的组织相容性。 2、组织学观察,DDM周围出现软骨样基质、骨样基质、软骨样细胞、成骨样细胞,表明DDM异位诱导成骨的动物模型建立成功；同时表明DDM具有骨诱导性。 3、从实验周期内观察,无论软骨样细胞Ⅱ型胶原表达的量还是维持时间,均比成骨样细胞多和长,表明DDM异位诱导成骨方式主要是软骨内成骨,是否膜内成骨尚需进一步研究。 4、在本实验观察周期内,TRAP染色显示无破骨细胞出现或者生成。
[Abstract]:Objective:
Through the observation of various cell evolution processes during DDM induced osteogenesis and immunohistochemical identification of mesenchymal stem cells, osteoblasts and chondrocytes, TRAP staining was used to observe osteoclasts, and to explore the cellular theoretical framework and the way of osteogenesis of DDM induced osteogenesis.
Method锛，

本文编号：1366053