CD45，CD90对分离得到大鼠骨髓间充质干细胞纯度的鉴定

发布时间：2018-01-02 00:21

  本文关键词：CD45，，CD90对分离得到大鼠骨髓间充质干细胞纯度的鉴定　出处：《中国医科大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BW-MSCs)的分离方法;应用流式细胞仪,用小鼠抗大鼠CD45, CD90检测分离得到BW-MSCs的纯度。 方法 在无菌条件下,采集双侧股骨,胫骨,用适量DMED／F12培养液冲出骨髓。用比重为1.073g／ml的Percol1分离液分离,取界面层,获取单个核细胞,用PBS液以1 000r／min离心洗涤,每次10 min,共2次。分离的细胞以5×104／cm2个接种于培养瓶。培养体系为高糖EMDM/F12(1:1),20%胎牛血清。在37℃,体积分数为5%CO2条件下培养,首次24 h更换培养液,去掉未贴壁细胞。每3d换液1次。每天在倒置相差显微镜下观察细胞形态。当细胞达到80%融合时,用1：1的0.1%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合液消化,用含2%小牛血清的PBS洗涤后制成1.0×107／ml骨髓MSCs的单细胞悬液,加入EP管中。之后按说明,取一定量CD90-FITC和CD45-PE加入EP管中。4℃避光孵育30min,流式细胞仪检测。 结果 1、采用密度梯度离心法和贴壁法相结合可从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。新鲜分离细胞在倒置显微镜下观察呈圆形,大小不均一。24 h细胞贴壁,更换培养液后,见贴壁细胞呈圆形,椭圆形,多边形。48 h见贴壁细胞体积变大,大小不均一,其浆核分界清楚,折光性强。绝大多数为单核,圆形,位于细胞中心位置。而后细胞形态仍然以圆形,椭圆形为主,长梭形的细胞逐渐出现。10-12天后大部分细胞变为长梭形,少部分呈多角形。12天左右可达80%融合。2、密度梯度离心法分离和贴壁法相结合得到的细胞,经小鼠抗大鼠CD90-FITC和CD45-PE双染后,应用流式细胞仪检测三次实验分离得到的细胞,CD9+CD45细胞的百分比40.02%,43.80%,42.63%。 结论 1、用比重为1.073g／ml的Percoll分离液离心之后贴壁培养可从大鼠股骨胫骨中分离得到骨髓间充质干细胞。2、CD45, CD90双染鉴定密度梯度离心法与贴壁法相结合分离得到骨髓间充质干细胞的百分比约为42.15%。
[Abstract]:Purpose To investigate the isolation method of bone marrow mesenchymal stem cells (BW-MSCs) from rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). The purity of BW-MSCs was determined by flow cytometry, anti-rat CD-45 and CD90. Method Under aseptic condition, bilateral femur and tibia were collected and the bone marrow was washed out with proper amount of DMED/F12 culture medium. The interfacial layer was separated with 1.073 g / ml Percol1 separation solution. Mononuclear cells were obtained and washed by centrifugation with PBS solution for 10 min each time. The isolated cells were inoculated in culture flask with 5 脳 10 4 / cm 2 cells for 2 times. The culture system was high sugar EMDM / F12: 1: 1% fetal bovine serum at 37 鈩

本文编号：1366876