人脐血间充质干细胞分离培养及向神经细胞定向诱导分化的研究

发布时间：2018-01-02 05:24

  本文关键词：人脐血间充质干细胞分离培养及向神经细胞定向诱导分化的研究　出处：《潍坊医学院》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 目的: 1、探讨人脐血间充质干细胞(MSCs)体外分离培养的最佳方法。 2、探讨人脐血MSCs向神经细胞定向诱导分化的最佳方案。 方法: 1、无菌条件下采集足月分娩和早产儿(不足37周)脐血,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(MNCs),比较不同条件对脐血MSCs原代培养过程的影响:(1)培养基:L-DMEM培养基、DMEM/F12培养基和Mesencult~(TM)培养基;(2)胎龄:足月妊娠和早产儿;(3)接种密度:5×10~5/cm~2、1×10~6/cm~2、5×10~6/cm~2、1×10~7/cm~2;(4)首次换液时间:2、3、4、5、6、7d。通过免疫荧光方法检测表面标记物CD29、CD34、CD44和CD90的表达情况,观察脐血MSCs的生物学特性。 2、第3代脐血MSCs,胰酶消化传代,待长至约80%融合时进行诱导,分三组:(1)化学诱导剂组:3mmol/Lβ-ME+20g/L DMSO+200mmol/L BHA;(2)生长因子诱导组:20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF;(3)丹参素+生长因子诱导组:3%香丹注射液(有效成分丹参素)+20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF。采用免疫细胞化学方法和(或)免疫荧光方法检测诱导前后神经元特异性标志(NeuN、β-TubulinⅢ)和星形胶质细胞特异性标志GFAP表达的变化。 结果: 1、足月分娩脐血,采用Mesencult~(TM)培养基,以5×10~6/cm~2的密度接种,首次换液时间为7d时,脐血MSCs原代培养成功率较高。相同培养条件下,早产儿脐血MSCs培养成功率高于足月分娩脐血。人脐血MSCs强表达CD29、CD44和CD90,不表达造血干细胞表面标志CD34。 2、免疫细胞化学方法检测结果:诱导前三组脐血MSCs的NeuN、β-TubulinⅢ、GFAP表达均为阴性;化学诱导后上述三种标志物的阳性率分别为(71.6±4.6)%、(73.8±2.3)%和(12.6±2.0)%;生长因子诱导后分别为(43.6±3.9)%、(54.6±4.1)%和(31.8±5.0)%;丹参素+生长因子诱导后分别为(78.6±4.5)%、(82.6±4.3)%和(15.6±3.6)%。免疫荧光方法检测发现:诱导前三组脐血MSCsβ-TubulinⅢ表达均为阴性,诱导后三组β-TubulinⅢ的阳性率分别为(72.6±2.7)%、(54.5±1.9)%和(79.8±3.0)%。 结论: 1、足月妊娠脐血采用Mesencult~(TM)培养基,以5×10~6/cm~2的密度接种,首次换液时间为7d,脐血MSCs原代培养成功率较高。相同培养条件下,早产儿脐血MSCs培养成功率高于足月分娩脐血。 2、丹参素联合生长因子EGF、bFGF在体外可诱导脐血MSCs分化为神经元样细胞,诱导效果最佳。
[Abstract]:Objective: 1. To investigate the best method for isolation and culture of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro. 2. To explore the best way to induce the differentiation of human umbilical cord blood MSCs into neuronal cells. Methods: 1. Cord blood was collected from full-term delivery and premature infants (less than 37 weeks) under aseptic condition, and MNCswere isolated by density gradient centrifugation. The effects of different conditions on the primary culture process of umbilical cord blood MSCs were compared. (2) gestational age: term pregnancy and premature infants; (3) the inoculation density is 1 脳 10 / 5 / cm ~ (-1) / cm ~ (-1) / 10 ~ (6) / cm ~ (2) / cm ~ (2) ~ (2) / (1 脳 10 ~ (7) / cm ~ (2)); The expression of CD29, CD34, CD44 and CD90 was detected by immunofluorescence method. The biological characteristics of MSCs in umbilical cord blood were observed. 2, the third generation of cord blood MSCs, trypsin digestion passage, waiting to grow to about 80% fusion for induction. Chemical inducer group: 3 mmol / L 尾 -ME 20 g / L DMSO 200mmol / L BHA; (2) growth factor induction group: 20 ng / ml EGF 20ng / ml bFGF; 3) Danshensu growth Factor Induction Group: 3% Xiangdan injection (Danshensu) 20ng / ml EGF 20ng / ml bFGF.Immunocytochemical method and (. Or) Neun, a neuron specific marker, was detected by immunofluorescence before and after induction. The expression of 尾-Tubulin 鈪，

本文编号：1367871