持续表达HCV全基因组小鼠模型的建立
本文关键词：持续表达HCV全基因组小鼠模型的建立 出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2008年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】： 丙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的疾病。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)急性感染后75%-85%转变为慢性感染,其中的10%-20%发展成肝硬化,且与肝细胞癌的发生密切相关。目前认为HCV感染后的慢性化机制归因于机体免疫功能的紊乱,肝细胞损伤的发生与免疫细胞及细胞因子在肝脏局部组织的浸润有关,但由于缺少合适的小动物模型,所以对HCV致病机制以及机体免疫系统所发挥的作用还缺乏深入的理解。因此探索一种具有实际应用价值的HCV全基因组表达模型具有非常重要的意义。 本课题基于成年小鼠,联合应用水动力转染技术与噬菌体整合酶系统,建立持续表达HCV全基因组小鼠的模型,作为经典转基因技术的补充或替代,可用于观察HCV长期表达引起免疫系统的变化及其与肝损伤的关系。具体研究内容及结果如下: 1.双顺反子表达质粒(pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES-HCV)的构建与鉴定。 以高效表达载体pCI-attB-AerApoEAATP为构架,该载体含有肝脏特异性调控序列组合AerApoEAATP(AAA)与噬菌体整合酶φC31-int识别位点attB,报告基因Fluc的表达活性反映了HCV全基因组的表达水平,将基因Fluc、EMCV IRES、HCV全功能基因依次连在启动子AerApoEAATP后面,构建 依赖帽子的扫描机制‖翻译表达Fluc, 非依赖帽子的扫描机制‖—EMCV IRES介导HCV全功能基因翻译的双顺反子表达质粒(pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES-HCV); 2. HCV全基因组在小鼠体内瞬时表达模型的建立 水动力转染方法是指从小鼠尾静脉快速(4-8s)注射大体积(达小鼠体重的8%-12%)含目的基因的生理盐水,从而实现外源基因在小鼠体内(尤其是肝脏内)的高效表达;应用此技术将表达载体pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCVIRES-HCV转染到具有正常免疫系统的Balb/c小鼠肝细胞内,以Fluc作为HCV全基因组的内参,通过活体荧光成像技术实时动态检测初步证实了HCV全基因组在小鼠体内得到表达,继而又通过RT-PCR、Western-blotting和免疫组织化学方法从RNA水平和蛋白水平进一步得到证实。但是要对病毒性肝炎慢性化机制进行研究,以及抗病毒药物在体内的长期作用效果进行评价,此模型存在明显的不足,所以如何延长HCV在小鼠体内的表达时间显得尤为重要。 3.HCV全基因组在小鼠体内长期表达模型的建立 噬菌体φC31整合酶是一种高效的整合工具酶,可以有效地将含有attB位点的质粒整合到含有attP同源序列的小鼠细胞基因组中去,所以我们利用水动力转染技术及噬菌体整合酶系统来实现目的基因在小鼠体内肝细胞中长期稳定表达。 通过水动力转染法将表达载体pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES -HCV及对照载体pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc分别与编码野生型φC31-int的表达载体pCMV-int共转染至Balb/c小鼠体内。在φC31-int作用下,表达框架整合到小鼠肝脏染色体上,在小鼠肝脏获得长期表达,在共转染后表达可长达90d以上。对获得长期稳定表达Fluc和HCV全基因组的小鼠分别行2/3肝脏切除术,肝切除后Fluc活性迅速下降,但是活体荧光成像显示仅表达Fluc的对照组小鼠两周后Fluc的表达量随肝脏组织再生而逐渐恢复,而表达HCV全基因组的实验组小鼠Fluc的表达量并没有随着术后时间的延长而恢复,所以我们对φC31-int介导下获得外源基因长期表达的小鼠是否整合继续鉴定,针对小鼠染色体上特异性整合位点中的热点—mpsL1设计引物,提取肝脏基因组进行nest-PCR,结果证实HCV全基因组表达框架在小鼠第2号染色体的mpsL1位点处发生位点特异性整合,生成两个杂合位点attR和attL,整合铰链区(core area)为TG,且有1-8个碱基的丢失,通过整合位点的正确鉴定说明HCV全基因组已经整合到小鼠染色体上并得到较长时期的表达。既然外源基因已经在小鼠体内得到整合,但HCV全基因组并没有随着术后时间的延长而恢复,说明HCV全基因组的整合可能抑制了肝脏的再生。 总之,本研究通过水动力转染技术及噬菌体整合酶系统联合应用,建立了HCV全基因组小鼠体内长期表达模型,可用于研究丙型病毒性肝炎的发生、发展演变及转归的整个过程,同时可了解免疫系统在整个致病过程中所发挥的作用,为今后抗HCV的疫苗筛选、药物评价和后期临床治疗奠定良好的基础。但是优化整合条件,提高整合效率,提高外源基因在小鼠体内的表达活性和稳定性仍然是今后工作需要解决的重要问题。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R-332
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