附睾蛋白酶抑制蛋白的B细胞表位筛选及其抗生育效应的实验研究

发布时间：2018-01-02 17:03

本文关键词：附睾蛋白酶抑制蛋白的B细胞表位筛选及其抗生育效应的实验研究　出处：《第三军医大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 免疫性避孕一直是男性避孕节育研究的重要领域,具有巨大的临床应用前景和良好的社会经济价值。然而迄今为止没有理想的避孕疫苗问世,究其原因最大的可能在于没有理想的靶抗原。作为避孕疫苗应用的的靶抗原应当至少满足两个条件,即抗原特异表达于生殖系统且参与生殖过程中的重要环节。近年来,附睾蛋白酶抑制蛋白(Epidydimal protease inhibitor,Eppin)因在非人灵长类动物实验中显示出可靠的避孕效应而备受关注。它特异表达于睾丸和附睾,在精子成熟和生殖过程中具有重要作用。利用重组Eppin蛋白免疫雄猴获得了78%抗生育效果,停止免疫后,71%的受试雄猴恢复了生育力。体外实验发现来自不育雄猴血清中的抗Eppin抗体可直接破坏人Eppin-精囊凝固蛋白(Semenogelin,Sg)复合体,干扰Eppin调控前列腺特异性抗原PSA对Sg的水解作用,影响人精子活动力,进而抑制生育力。因此,Eppin可能成为理想的避孕疫苗靶抗原。虽然对Eppin的研究有了一定的进展,但仍存在如下问题:(1)蛋白抗原分子量较大,难以实现质量控制;(2)未对抗原中可能导致远期毒副反应的不良表位做剔除或加工。(3)抗体产生不稳定;(4)隐匿的保护性表位功能未能表达,所引发的保护性免疫不够强大,免疫避孕效果不理想。因此,为了提高Eppin抗原的保护性,就不得不从天然抗原整个分子水平向表位水平过渡:摒除不良表位,保留、改善保护性表位以得到更理想的疫苗分子。表位是蛋白质抗原性的基础,正确而详细地绘制蛋白质表位图谱对设计疫苗分子结构及免疫干预治疗等具有重要意义。本研究首先通过RT-PCR法从人新鲜睾丸组织扩增获得Eppin cDNA,构建入原核表达载体,诱导表达并经纯化获得重组人Eppin蛋白(第一部分)。同时,利用生物信息学方法分析Eppin蛋白的二级结构及抗原性、亲水性、柔韧性、表面可及性等理化特性,预测Eppin蛋白的主要功能区域,根据该区域抗原趋势指数分析结果,采用错位重叠套式方法设计该区域的肽段。利用人工合成肽技术固相合成多肽,并与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清蛋白(BSA)偶联,用KLH偶联肽与弗氏完全佐剂、不完全佐剂等体积混合,充分乳化后足垫皮下注射免疫小鼠,通过间接ELISA方法观察各个表位肽刺激抗体的产生,通过体外、体内抗生育实验观察表位肽的抗生育效应,以此筛选出其优势中和B细胞表位,并以rhEppin免疫为阳性对照,分析其抗生育潜能及安全性(第二部分)。最后,设计并制备基于Eppin优势B细胞表位的2分支MAP抗原肽,以弗氏佐剂为佐剂,腹部皮下免疫雄性恒河猴,ELISA方法监测免疫后被免疫雄猴血清抗体滴度,CBA方法检测Th1/Th2细胞因子的改变,睾丸活检术取睾丸标本电镜观察免疫后睾丸超微结构的变化,并与发情期雌猴合笼2个周期,观察Eppin的MAP抗原肽对恒河猴的抗生育效果(第三部分)。结果显示:①成功构建了pET-32a-Eppin重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Eppin蛋白。②通过分析Eppin蛋白二级结构及表面特性,初步预测出Eppin蛋白的89～133位氨基酸为主要功能区域,设计合成8条代表该氨基酸区域的肽段,并与载体蛋白KLH偶联,命名为F1-F8。③采用偶联肽足垫皮下注射免疫小鼠,发现8个候选表位肽都能激发高滴度的抗体,但仅F5肽所获得的抗血清能与人精子天然Eppin蛋白结合,并能显著抑制精卵结合,使雄鼠的生育力受到很大限制,从而获得Eppin优势中和B细胞表位为F5:FVYGGCQGNN(105～114区段)。④Eppin的MAP抗原肽免疫的10只雄猴中有2只血清IgG抗体滴度始终无明显提高,淘汰,剩余8只抗体滴度可达1:400~1600,但需2~3周加强免疫一次。合笼后发现对照组5只有4只受孕,实验组8只仅3只受孕,显示了较肯定的避孕效果。电镜结果未发现免疫后睾丸组织超微结构的损害,CBA细胞因子检测未见Th1/Th2极化改变,各细胞因子免疫前后无明显差异。提示合成肽对T细胞功能的影响甚微,今后的剂型改造可以考虑增强T细胞功能,在佐剂、递呈方式上做优化。本研究结果表明生物信息学方法表位预测并合成偶联肽免疫策略是筛选蛋白优势中和B细胞表位的有效方法;Eppin蛋白的第105～114区段是Eppin优势中和B细胞表位区域;Eppin表位肽用于免疫避孕具有较好的安全性和有效性;基于Eppin优势表位的避孕疫苗尚需要在表位水平进一步修饰改造才能满足人用避孕疫苗的要求。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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