MicroRNA-486在造血细胞红系分化中的表达及机制研究

发布时间：2018-01-03 10:40

  本文关键词：MicroRNA-486在造血细胞红系分化中的表达及机制研究　出处：《安徽医科大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子。miRNA主要在转录和转录后发挥对基因的调控作用，包括造血干细胞的自我更新和分化过程，但其在造血细胞分化的表达及其对分化的调控作用并不清楚。 MicroRNA 486（miR 486）首先在人胎肝组织中被鉴定，，因为人胎肝组织是造血增殖分化最旺盛的组织之一，利用经典方法从胎肝组织中鉴定的miRNA无疑是高丰度并可能参与造血生成过程调节的重要miRNA。miR 486基因组学分析表明该基因（Gene ID：619554）位于8号染色体Ankyrin 1（Ank 1）基因的第40个内含子（8p11.21位点）。Ank 1在肌肉组织、红细胞及脑组织等组织中广泛存在，但与造血干细胞调控的关系仍然不清楚。本论文将对miR 486在造血干细胞分化中的表达变化及调控机制进行阐述。 本课题首先利用实时定量PCR（real time PCR）方法检测了小鼠各脏器及血液中miR 486的表达情况，结果发现miR 486在血液、肌肉和心肌中高表达,并且其在造血细胞中表达量最高。我们课题组前期研究工作基础：在比较慢性粒细胞白血病（CML）和正常CD34+细胞MicroRNA表达谱时发现miR 486在CML CD34+细胞高表达，进一步证明miR 486与CML BCR ABL融合基因的促红系分化相关。第二，分离人脐带血CD34+细胞，并在含有不同造血生长因子组合的培养体系中进行分化诱导并利用流式细胞仪检测造血细胞分化效率，同步利用RT QPCR方法检测miR 486的表达。结果发现随着造血干细胞向红系分化，miR 486表达水平随之增高；第三，文献调研显示：GATA1是第一个被识别也是最重要的GATA家族因子，在红系细胞中大量表达，同时也是在红系分化和成熟过程中起关键作用的中心转录因子，许多具有红系特异功能的基因均受GATA1的调控。我们通过慢病毒介导的GATA1沉默策略，沉默脐带血CD34+细胞GATA1的表达，并同步检测miR 486的表达水平。结果发现GATA1的沉默效率可以达到82%，可以有效阻断CD34+细胞向红系分化，同时miR 486的表达水平也明显降低。克隆形成实验,第10天时计数红系集落，对照组红系集落数为54±4.89，GATA1沉默组红系集落数为16±5，P＜0.05，结果表明GATA1沉默抑制脐带血CD34+细胞的红系分化，与分化实验结果相符。以上结果均证明了miR 486在造血干细胞红系分化过程中起到重要的作用。 MicroRNA通过3’UTR调控靶基因表达并发挥其生物学效应。单一MicroRNA可以调控多个靶基因的表达，而单一靶基因也可受到多个MicroRNA的调控。通过靶基因的分析可以预测MicroRNA的生物学功能。我们利用Targetscan6.2检索发现miR 486存在多个预测靶基因，其中FOXO1，PTEN，ARID4B等与白血病发病密切相关。为此我们克隆了ARID4B基因的3′UTR并构建了PGL 3M荧光素酶报告载体,将报告载体和miR 486表达载体共转染HEK293细胞，并测定荧光素酶报告活性。结果以对照组MCS的相对荧光强度为1，miR 486组相对荧光强度为0.631±0.083，miR 486组荧光强度降低了37%。以上结果表明miR 486有可能通过抑制ARID4B发挥生物学功能。 综上，本研究结果可以得出以下结论：miR 486参与造血干细胞分化的调节，是一种与红系造血分化密切相关的microRNA，并有可能通过其靶基因ARID4B发挥生物学功能。
[Abstract]:MicroRNA ( miRNA ) is a kind of non - coding single - stranded RNA molecule with a length of about 22 nucleotides encoded by endogenous gene . miRNA plays a role in regulating gene regulation after transcription and transcription , including self - renewal and differentiation of hematopoietic stem cells , but its expression in hematopoietic cell differentiation and its regulation on differentiation are not clear .

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本文编号：1373559