肽脱甲酰基酶的表达纯化及其抑制剂的研究

发布时间：2018-01-03 16:34

  本文关键词：肽脱甲酰基酶的表达纯化及其抑制剂的研究　出处：《天津医科大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的： 肽脱甲酰基酶(PDF, peptide deformylase)是筛选新型抗生素的一个理想靶点,其抑制剂的研究引起了广泛的关注。在本研究中,通过不同的表达纯化方法,获得稳定性好、活性高的大肠杆菌和金黄色葡萄菌的PDF,建立PDF抑制剂的筛选模型。检测其抑制剂对两种PDF的抑制效果,同时检测PDF抑制剂的最小抑菌浓度(MIC, minimal inhibitory concentration),对抑制剂进行筛选。为PDF性质的研究和新型抗生素的筛选奠定良好的基础。 方法： 1.将大肠杆菌PDF表达质粒pET-22b-def转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,对诱导表达的条件进行摸索,并进行PDF蛋白的大量表达。 2.通过离子交换层析和分子筛层析,对大肠杆菌PDF进行纯化。 3.检测大肠杆菌PDF的活性及稳定性。 4.构建金黄色葡萄球菌PDF重组表达质粒pET-22b-def。 5.将金黄色葡萄球菌PDF表达质粒pET-22b-def转入宿主大肠菌BL21(DE3)中,进行诱导表达,采用琼脂糖磁珠对其进行纯化,得到不含离子的PDF；在纯化过程中加入氯化镍,得到镍离子PDF；在表达和纯化过程中加入氯化铁,得到富含铁离子的PDF。 6.对金黄色葡萄球菌三种不同形式的PDF进行活性比较,并对抑制剂筛选模型的条件进行摸索,建立合适的筛选模型。 7.检测化合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌PDF的ICso值。 8.应用微量稀释法敏感实验的方法检测了39种化合物对4株革兰阴性菌和4株革兰阳性菌的MIC值。 结果： 1.在30℃下,经0.2mMIPTG诱导表达4小时,大肠杆菌PDF蛋白在宿主菌中得到大量表达。1L菌液可表达蛋白约30mg。 2.经过离子交换层析和分子筛层析纯化后,得到了高纯度的大肠杆菌Ni2+-PDF蛋白。 3.活性检测证实我们得到了活性高、稳定性好的大肠杆菌Ni2+-PDF蛋白,可用于PDF抑制剂的筛选。 4.重组菌落PCR鉴定和基因测序表明,我们成功构建了金黄色葡萄球菌PDF表达质粒pET-22b-def。 5.在不同的表达和纯化条件下,得到了高纯度的未加入离子的PDF、含镍离子PDF、富含铁离子PDF三种不同形式的金黄色葡萄球菌PDF蛋白。 6.金黄色葡萄球菌不含离子PDF、镍离子PDF和富含铁离子PDF经活性比较发现,富含铁离子PDF活性最高,并用于体外PDF抑制剂的筛选实验。 7.检测了39种化合物对大肠杆菌PDF抑制效果,与阳性对照药物放线酰胺(actinonin)相比较,未发现抑制效果优于actinonin的药物。另外检测了19种化合物对金黄色葡萄球菌PDF的抑制效果,亦未发现抑制效果优于actinonin的药物。 8.在微量稀释法敏感实验中,与阳性对照药庆大霉素相比,所筛选化合物抑菌效果差于庆大霉素,与actinonin相比,BLC-44对大肠杆菌和克雷伯肺炎杆菌的抑菌效果优于actinonin,其他药物抑菌效果不及actinonin。 结论： 经表达纯化,获得了稳定性好及活性高的大肠杆菌Ni2+-PDF和金黄色葡萄球菌的富含铁离子PDF蛋白,并建立了PDF抑制剂的筛选的实验模型。对化合物进行了筛选,与阳性对照药actinonin相比,未发现抑制效果优于actinonin的药物。在MIC的检测中,亦未发现抑菌效果好药物。
[Abstract]:Objective:
Peptide deformylase (PDF peptide deformylase) is an ideal target for screening new antibiotics, study its inhibitors has attracted widespread attention. In this study, through the expression of different purification methods, to obtain good stability, high activity of Escherichia coli and Staphylococcus aureus PDF, screening model detection of PDF inhibitors. The inhibition effect of inhibitors on the two PDF, the simultaneous detection of the minimum inhibitory concentration of PDF inhibitors (MIC, minimal, inhibitory, concentration) were screened. The inhibitor for the study of PDF properties and new antibiotic screening to lay a good foundation.
Method锛，

本文编号：1374717