体外持续传代对人胎儿来源干细胞生物学特性影响的研究

发布时间：2018-01-04 02:42

  本文关键词：体外持续传代对人胎儿来源干细胞生物学特性影响的研究　出处：《大连医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：研究体外持续传代对两种人胎儿来源干细胞（脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞）基本特性、致瘤性及干性等生物学特性的影响，为干细胞的质量监控提供实验依据。 方法：使用相同方法分离获得的原代脐带间充质干细胞（n=3）和羊膜上皮细胞（n=8）进行持续传代培养，研究第7、14和21代脐带间充质干细胞基本特性（形态、增殖、细胞周期、凋亡和衰老）、致瘤性（染色体数量和致瘤基因表达）以及干性（表型、干性基因表达、心肌、神经和肝分化能力）的差别，并探讨原代羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达水平与体外培养后细胞表型以及分化能力变化的关联性。 结果： 1.持续传代对脐带间充质干细胞生物学特性的影响 1）持续传代对脐带间充质干细胞基本特性的作用规律 初代的脐带间充质干细胞呈长梭形，随着传代次数的增加，部分细胞变得宽大，细胞增殖速率下降，出现了S和G2期阻滞现象，但三个代数细胞间无统计学差异。此外，三个代数细胞均未发生明显凋亡：活细胞（Annexin V-/PI-细胞）比例均超过90%，无统计学差异。然而，与第7代及第14代相比，第21代衰老细胞比例显著增高（P7：0.032±0.018；P14:0.062±0.038；P21:0.229±0.019）。衰老相关的P21基因表达也显著升高（P21：0.050±0.020，P14：0.007±0.001，P7：0.010±0.004）（P0.05）。上述实验结果表明，第14代以内的脐带间充质干细胞能够较好地保持其基本特性，而第21代细胞则出现了明显衰老。 2）持续传代对脐带间充质干细胞致瘤性的作用规律 三个代数细胞染色体数量未发生变化，癌基因E-Ras的表达无统计学差异。然而，第21代癌基因c-Myc（0.047±0.005）的表达则显著高于第7（0.014±0.006）和14代（0.011±0.002）（P0.05）。这些结果表明，尽管第21代细胞染色体数量正常，但癌基因的表达会出现明显上调，提示高代数细胞可能具有较高的致瘤性。 由于第21代细胞衰老和癌基因表达均显著升高，因此在之后的干性研究中只选择使用第7和第14细胞。 3）持续传代对脐带间充质干细胞干性的作用规律 三个代数细胞的间充质干细胞典型的表面标志物（CD73、CD90和CD105）表达均高于99%，不表达造血干细胞标记物HLA-DR和CD45，各代数无统计学差异。与第7代细胞相比，，第14代细胞的干性基因Oct3/4（P7：2.378E-5±1.347E-5，P14：1.955E-5±3.692E-6）、Nanog（P7：1.063E-5±5.722E-6，P14：6.517E-6±2.666E-6）、Vimentin （P7：0.507±0.144，P14：0.323±0.041），外胚层祖细胞标志物Nestin（P7：9.421E-4±2.011E-4，P14：6.952E-4±2.906E-4）和中胚层祖细胞标志物GATA4（P7：3.215E-5±3.716E-5，P14：5.082E-6±5.293E-6）的表达有下调趋势，内胚层祖细胞标志物AFP（P7：5.891E-5±2.439E-5，P14：9.916E-5±2.620E-5）有上调趋势，但无统计学差异。另外，心肌诱导分化实验结果显示：第7代细胞的心肌标志物α-actinin的蛋白表达（0.111±0.030）显著高于第14代（0.033±0.006）细胞（P0.05），这说明第7代细胞具有较高的心肌分化能力。神经诱导分化实验结果则显示：第14代细胞中Nestin（27.2±12.0%）、β-tubulin Ⅲ（70.4±4.5%）阳性细胞的比例较之第7代（Nestin：20.9±0.8%；β-tubulinⅢ：38.6±10.2%）细胞表达升高， β-tubulin Ⅲ有统计学差异（P0.05）， Nestin无统计学差异（P0.05），这说明第14代细胞具有较高的神经分化能力。此外，早期肝诱导分化实验结果发现，第7代细胞的肝功能标志物Albumin的基因（P7：16.433±12.921，P14：12.967±1.358）（P0.05）及蛋白表达（P7：0.382±0.270，P14：0.260±0.127）有高于P14代的趋势，但无统计学差异，提示第7代细胞可能具有较高的肝分化潜能，但受到个体差异的影响。 2.持续传代对羊膜上皮细胞生物学特性的影响 流式细胞仪分析表明，不同样本来源的原代羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达在26.7%-97%之间，存在很大的个体差异。第2代细胞与原代细胞相比，SSEA-4表达水平明显降低，其下降程度与原代细胞SSEA-4的表达水平无关。另外，传代培养后羊膜上皮细胞的心肌分化潜能也存在很大个体差异，且其差异与原代细胞SSEA-4表达水平的高低无关。 结论： 1.第14代之内的脐带间充质干细胞较好地保持了其基本特性，未发生明显衰老，且具有较低的癌基因表达，因此更适合再生医学研究与应用。 2.脐带间充质干细胞分化实验表明，尽管受到个体差异的影响，但是体外持续传代对不同分化方向有不同的作用规律，较低代数细胞的心肌及肝分化能力可能较高，而较高代数细胞的神经分化能力可能较强，因此在具体应用中需要考虑体外传代对脐带间充质干细胞具体分化方向及能力的影响，尽可能选择适合代数的细胞，同时加强干细胞的质量监控，以提高安全性和有效性。 3.不同样本来源的原代羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平受到个体差异的影响，需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得原代高表达SSEA-4的胎儿样本，以实现对羊膜上皮细胞的质量监控。另外，体外培养过程中SSEA-4的表达水平受到培养条件的影响，需要继续优化培养条件以维持其高表达。此外，羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力受到样本个体差异以及培养条件的影响，在今后还需要进一步研究。
[Abstract]:Objective: To study the effects of continuous passage on biological characteristics of two human fetal stem cells (umbilical cord mesenchymal stem cells and amniotic epithelial cells), including tumorigenicity and dry matter, and provide experimental basis for quality monitoring of stem cells.
Methods: using the same method of isolated primary human umbilical cord mesenchymal stem cells (n=3) and human amniotic epithelial cells (n=8) were continuously subcultured on the 7,14 and the 21 generation of human umbilical cord mesenchymal stem cells basic characteristics (morphology, proliferation, cell cycle, apoptosis and senescence), tumorigenicity (chromosome number and tumorigenic gene expression) and dry (dry phenotype, gene expression, cardiac muscle, nerve and liver differentiation) differences, and to explore the expression level and in vitro dry primary amniotic epithelial cell marker SSEA-4 cultured cell phenotype and differentiation ability changes of relevance.
Result锛

本文编号：1376708