肺炎嗜衣原体CPAF重组蛋白致小鼠肺组织炎症及对炎症细胞因子影响的研究
本文关键词：肺炎嗜衣原体CPAF重组蛋白致小鼠肺组织炎症及对炎症细胞因子影响的研究 出处：《南华大学》2008年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】： 目的:将本室构建的肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease like activity factor,CPAF)的181～400aa基因(CPAFm)的重组表达体在大肠杆菌中诱导表达,纯化表达产物并进行鉴定,研究该重组蛋白在BALB/c小鼠体内引起的肺部炎症改变及对炎症细胞因子TNF-α和IL-6的水平的影响,为进一步探索CPAF在Cpn感染中的致病作用提供实验依据。 方法:重组质粒pGEX6p-2/CPAFm,经酶切和测序鉴定后,转化至E.coli BL21中,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物;复性后用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)琼脂糖凝胶FF纯化重组蛋白,A280紫外分光光度法测定纯化蛋白浓度。将纯化的重组蛋白第1d、3d、6d鼻内或尾静脉注射BALB/c小鼠,第7d处死小鼠,HE染色观察肺组织病理形态学改变,常规血细胞计数法计外周血与支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)中白细胞总数,瑞氏染色观察外周血与BALF中白细胞分类计数, ELISA方法检测血浆和BALF中的TNF-α和IL-6的水平。 结果:重组目的基因表达菌在IPTG的诱导下,表达了相对分子质量(Mr)约51.3 kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在,经GST琼脂糖凝胶FF纯化得到纯度达95%以上的重组蛋白。重组蛋白能引起BALB/c小鼠肺组织的炎症病理损伤,光镜下见BALB/c小鼠的肺组织出现中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润,对照组与正常组BALB/c小鼠肺组织未见明显病理改变。尾静脉注射实验组的BALB/c小鼠外周血中性粒细胞比例明显高于GST、PBS对照组和正常组(均P㩳0.01),单核细胞比例明显高于GST对照组(P㩳0.05)、PBS对照组(P㩳0.05)和正常组(P㩳0.01);鼻内滴入实验组BALB/c小鼠BALF中白细胞总数明显高于GST对照组(P㩳0.05)、PBS对照组(P㩳0.05)和正常组(P㩳0.01);鼻内滴入实验组外周血中炎症因子IL-6水平显著高于GST、PBS对照组和正常组(均P㩳0.01),TNF-α水平明显高于GST对照组(P㩳0.05)、PBS对照组(P㩳0.01)和正常组(P㩳0.01);尾静脉注射实验组外周血中炎症因子IL-6的水平明显高于GST、PBS对照组与正常组(均P㩳0.01);鼻内滴入和尾静脉注射实验组BALF中炎症因子IL-6、TNF-α的水平明显高于GST、PBS对照组与正常组(均P㩳0.01)。 结论: 1、成功表达纯化得到51.3 kDa的GST-CPAFm重组蛋白和26kDa的GST蛋白; 2、GST-CPAFm重组蛋白能引起BALB/c小鼠肺组织的炎症病理损伤; 3、GST-CPAFm重组蛋白能引起BALB/c小鼠体内炎症细胞增多和炎症因子TNF-α、IL-6的水平的升高。
[Abstract]:Objective: to construct Chlamydophila pneumoniae of Chlamydophila pneumoniae. CPN) protease-like activity factor Chlamydial protease like activity factor. The recombinant expression of CPAF-181h400AA gene was induced and expressed in Escherichia coli, the expressed product was purified and identified. Objective: to study the changes of pulmonary inflammation induced by the recombinant protein in BALB/c mice and its effect on the levels of inflammatory cytokines TNF- 伪 and IL-6. To provide experimental basis for further exploring the pathogenicity of CPAF in Cpn infection. Methods: the recombinant plasmid pGEX6p-2 / CPAFm was digested and sequenced, then transformed into E. coli BL21. The expressed products were analyzed and identified by SDS-PAGE and Western blot. The recombinant protein was purified by glutathione S-transferase (GST) agarose gel FF after renaturation. A280 UV spectrophotometry was used to determine the concentration of purified protein. The purified recombinant protein was injected intranasal or caudal intranasal or caudal vein for 6 days on the 1st day, and the mice were killed on the 7th day. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining. The peripheral blood and bronchoalveolar lavage fluids were measured by routine blood cell count method. The total number of white blood cells in BALF, the number of leukocytes in peripheral blood and BALF were observed by Rayleigh staining, and the levels of TNF- 伪 and IL-6 in plasma and BALF were detected by ELISA method. Results: the recombinant target gene expression strain induced by IPTG expressed a target protein of about 51. 3 kDa. Objective protein mainly exists in the form of inclusion body in the cell. Purified by GST agarose gel FF, a recombinant protein with purity of more than 95% was obtained. The recombinant protein can induce inflammatory pathological damage in lung tissue of BALB/c mice. Under the light microscope, the lung tissue of BALB/c mice showed neutrophils, mononuclear macrophages, lymphocytes and other inflammatory cells infiltration. There were no obvious pathological changes in lung tissue of BALB/c mice in control group and normal group. The percentage of neutrophils in peripheral blood of BALB/c mice injected with caudal vein was significantly higher than that of GST. PBS control group and normal group (all P? The percentage of monocytes was significantly higher than that of GST control group. PBS control group (P < 0.05). 0. 05) and normal group P? The total number of leukocytes in BALF of experimental group BALB/c mice was significantly higher than that of GST control group. PBS control group (P < 0.05). 0. 05) and normal group P? The level of inflammatory factor IL-6 in peripheral blood of the experimental group was significantly higher than that of the control group and the normal group. The level of TNF- 伪 in GST group was significantly higher than that in control group. PBS control group (P < 0.05). 0. 01) and normal group P? The level of inflammatory factor IL-6 in peripheral blood of the caudal vein injection group was significantly higher than that of the control group and the normal group. The level of IL-6 TNF- 伪 in BALF of the experimental group was significantly higher than that of the control group and the normal group (P < 0.01), and the level of IL-6 TNF- 伪 in the experimental group was significantly higher than that in the control group and the normal group (P < 0.01). 0.01g. Conclusion: 1. 51.3 kDa GST-CPAFm recombinant protein and 26kDa GST protein were successfully expressed and purified. 2GST-CPAFm recombinant protein can induce inflammatory pathological injury in lung tissue of BALB/c mice. 3GST-CPAFm recombinant protein could induce the increase of inflammatory cells and the level of TNF- 伪 IL-6 in BALB/c mice.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R363
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，本文编号：1394562
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