PNRC在核仁的定位、功能及其剪接变异体的分析

发布时间：2018-01-10 00:02

本文关键词：PNRC在核仁的定位、功能及其剪接变异体的分析　出处：《第三军医大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 核受体(nuclear receptor, NR)是一类转录因子,在调节机体的生殖、发育和体内稳态等过程中发挥极其重要的作用。核受体调节基因的转录通常需要募集辅调节子(coregulator)。在配体的作用下,核受体的构象发生变化,变募集辅抑制子(corepressor)为募集辅活化子(coactivator),靶基因转录从抑制转变为激活。富含脯氨酸核受体辅调节蛋白(proline-rich nuclear receptor coregulator protein, PNRC)是以类固醇衍生因子1(steroidogenic factor 1,SF1)为诱饵,利用酵母双杂交技术从人乳腺cDNA表达文库筛选并鉴定的一核受体辅活化子(coactivator),除与SF1和孤儿受体ERRα及ERRγ相互作用外,PNRC还与ERα、ERβ、PR、GR、TR、RAR和RXR等核受体相互作用,增强其介导转录激活。此外,PNRC还能与Grb2相互作用,下调Ras和MAP激酶的激活。最近又发现PNRC通过与RNA多聚酶Ⅲ(RNA polⅢ)亚基RPC39结合刺激RNA polⅢ介导的转录。 PNRC主要在细胞核内发挥功能,先前的研究也表明PNRC分子主要定位在细胞核内,但PNRC只有327氨基酸,分子量35.2 kD,理论上能自由进出细胞核,因此我们推测PNRC分子上存在一定的核定位信号序列(nuclear localization signal, NLS)使其定位在细胞核内而不扩散到胞浆中。本研究在鉴定PNRC NLS的过程中,发现PNRC定位在核仁中并参与RNA多聚酶Ⅰ(RNA polⅠ)介导的核糖体RNA(rRNA)的合成。通过一系列的突变分析,我们鉴定位于94-101的氨基酸序列(94PKKRRKKK101)为PNRC的核仁定位序列(nucleolar targeting sequence,NTS)以及NLS。将此序列直接融合到绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)能将其带到细胞核和核仁中。对PNRC NTS上的氨基酸残基进行逐点替代突变分析,发现位于氨基酸序列第100位的赖氨酸(lysine-100)是其NTS的关键残基,但不是NLS的关键残基,因为突变此氨基酸能显著减少PNRC在核仁的定位,但不改变PNRC在细胞核中的定位。另外,我们证明像KKRRKK、KKKKKK和RRRRRR等连续的6个碱性氨基酸残基就足于将GFP带到核仁,因此它们可以做为潜在的NTS。通过免疫共沉淀实验我们发现PNRC与核仁的主要蛋白—核磷蛋白(B23/nucleophosmin)相互作用,且PNRC作用位点为其NTS。我们还发现:当用低剂量放线菌素D(actinomycin D)抑制核糖体DNA(rDNA)的转录时,PNRC从核仁转位到核浆中,而用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞则可增加PNRC在核仁的积累。此外,在乳腺癌细胞系MCF-7细胞中,用小干扰RNA(siRNA)敲低PNRC的表达能显著减少核糖体RNA(rRNA)的合成以及特异性地降低参与rRNA合成的核仁素(C23/nucleolin)的蛋白水平,而过表达PNRC则能升高核仁素的蛋白水平。总之,我们的结果表明PNRC是一核仁蛋白,位于94-101的氨基酸序列(94PKKRRKKK101)是其NTS,也是其NLS。PNRC可能通过这一序列与B23相互作用而定位到核仁中,并通过调节核仁素蛋白的水平参与rRNA的合成。由于mRNA水平的选择性剪接是调节蛋白功能的一个重要手段,本课题在生物信息学分析的基础上,通过克隆测序的策略鉴定了三个PNRC剪接变异体,分别命名为PNRC1c、PNRC1d和PNRC1f PNRC1c和PNRC1f是在PNRC基因外显子1中选择性剪切掉部分序列的产物,而PNRC1d则为PNRC基因选择性使用另外一个启动子的产物。PNRC1 c在选择性剪接位点后面的序列未发生翻译的读码移框,而只是框内删除79个氨基酸,而PNRC1f则在选择性剪接位点其后的序列发生读码移框,并提前出现终止密码子,PNRC1d编码出的蛋白则为组成性剪接PNRC分子C末端的142个氨基酸。通过酵母双杂交和报告基因分析等实验,我们发现这些剪接变异体在与核受体的相互作用及辅激活核受体介导的转录的能力上存在极大的差异。另外,我们还发现剪接变异体PNRC1d具有调节组成性剪接体PNRC辅激活雌激素受体(ER)的功能。总之,此部分的研究表明PNRC存在功能不同的剪接变异体,选择性剪接调节PNRC辅活化子的活性。
[Abstract]:Nuclear receptor ( NR ) is a kind of transcription factor , plays a very important role in regulating the reproduction , development and homeostasis of organism . The transcription of nuclear receptor regulates gene usually needs to raise coregulator . Under the action of ligand , the conformation of nuclear receptor changes , coregulator is coactivator , and the transcription of target gene is changed from inhibition to activation . In addition , PNRC interacts with the nuclear receptors such as ER伪 , ER尾 , PR , GR , TR , RARs and RXR to enhance the activation of Ras and MAP kinases . In addition , PNRC can interact with Grb2 to downregulate the activation of Ras and MAP kinases . In this study , we found that PNRC is a key residue in the nucleolus , but it is not a key residue of the PNRC . In addition , we have shown that PNRC is a key residue in the nucleolus , but it is not a key residue of the nuclear nucleolus . In addition , we prove that PNRC is a nuclear protein , and the amino acid sequence of PNRC is a nucleolar protein , and the amino acid sequence of PNRC is 94 - 101 ( 94PKKRRK101 ) . In this paper , we identified three PNRC splice variants , PNRC1c , PNRC1d and PNRC1f PNRC1c and PNRC1f , respectively , which were named PNRC 1c , PNRC1d and PNRC1f PNRC1c and PNRC1f .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346

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