肝细胞生长因子浓度对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

发布时间：2018-01-15 18:05

本文关键词：肝细胞生长因子浓度对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响　出处：《郑州大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景及目的目前心血管疾病已成为严重威胁人类健康的主要疾病之一,尤其以心肌缺血性疾病(ischemic heart disease,IHD)最为常见,而心肌梗死(myocardialinfarction,MI)作为其中最为严重的一种类型是人们关注的焦点。目前,药物、介入以及外科手术等心肌梗死的常用治疗方法虽可使心脏闭塞的血管再通,改善心肌缺血和充血性心力衰竭(congestive heartfailure,CHF)的症状,但却不能从根本上恢复心肌细胞数量,改善心脏舒缩功能。心脏移植虽可从根本上解决心室重构问题,但因受到技术、供体来源、费用以及社会、伦理道德等多种限制,目前尚无法广泛应用。随着组织工程学及干细胞研究的深入,干细胞的分离、纯化以及体外定向分化的技术得到了很大程度地提高。通过诱导干细胞定向分化为心肌细胞,并进行细胞移植来代替坏死心肌细胞,理论上可能达到改善心功能的目的,为心梗的治疗提供了一种新的研究方向。但并非任何干细胞都能担当这一角色,胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESs)和骨骼肌干细胞就被排除,前者由于来源及伦理问题应用受限,而后者因为分化成熟后无法与宿主细胞建立电机械偶联。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓基质细胞的前体,主要存在于网状间质内,而且在体外特定的诱导条件下,可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等,还具有取材方便、连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能的优点,并已有众多研究证实其可用于自体移植。故而,诱导MSCs分化为心肌细胞并将之通过细胞移植用于心肌梗死的治疗目前已经成为研究的热点之一。目前,诱导MSCs向心肌细胞分化的研究主要集中于化学诱导分化,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)被证实是最有效化学制剂,但其诱导MSCs分化为心肌细胞的转化率也始终低于20%～30%,且具有细胞毒性作用,临床应用受到极大地限制,这就使寻找更为合适的诱导剂成为研究的热点。有研究认为,某些细胞因子如肝细胞生长因子(hepatocyte growth facto,HGF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)等在骨髓间充质细胞定向分化中起着重要的作用,并有足够的理论和实验表明使用细胞因子作为诱导分化剂在体外诱导干细胞分化为心肌细胞可能具有重要的研究与应用价值,而且相比5-氮胞苷等众多已有研究的化学物质,细胞因子没有细胞毒性作用,是较为理想的干细胞诱导剂。HGF是由间质细胞分泌的一种多功能的细胞因子,它具有调节细胞生长和运动,促进多种细胞组织形态的发生等作用;它还是一种心肌营养因子,具有很强的促血管内皮细胞有丝分裂,修复内皮损伤,抑制细胞凋亡与组织重构的作用。近年来MSCs向心肌细胞方向转化的诱导研究多局限于细胞培养、动物实验,而人骨髓间充质干细胞(human Bone Marrow messenchymal Syem Cells,hMSCs)的体外分离、纯化、定向诱导的研究报道尚少,关于HGF诱导hMSCs向心肌细胞分化的研究报道就更为鲜有。结合上述研究现状,本研究选择人骨髓间充质干细胞(hMSCs)作为研究对象,采用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离纯化hMSCs,并在体外用不同浓度的HGF诱导分离纯化后的hMSCs,旨在探讨HGF是否能成功诱导hMSCs向心肌细胞分化以及HGF的浓度对MSCs的诱导作用是否有影响。材料与方法: 1.标本:骨髓来自郑州大学第一附属医院心脏外科2007年～2008年非青紫型先天性心脏病患者,所有患者术前均排除血液系统疾病,并征得医学伦理委员会批准及患者知情同意。 2.处理:胸骨穿刺抽取骨髓3～5ml骨髓,肝素(100U/ml)抗凝后即送实验室,按比例加入percoll分离液(密度1.073g/mL)行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,再利用贴壁筛选法纯化hMSCs后,进行原代传代培养。 3.分组:取第3代传代细胞,分为6组:①～⑤组为实验组,分别加入3μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和40μg/L HGF,连续培养4w,每3d换液1次;⑥组为阴性对照组,不加入HGF,其余条件与实验组相同。 4.结果判定:所有分组均在显微镜下连续观察诱导细胞的形态变化,并详细记录;再于第四周行免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)及心肌特征性蛋白缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达,胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,用cTnI阳性细胞所占比例计算转化率。 5.统计学方法:运用SPSS13.0统计学软件,多个样本均数的比较采用Kruskal-Wallis H检验(H检验),组间比较采用Student-Newman-Keuls检验,取α=0.05为检验水准。结果 1.显微镜下连续观察结果:经HGF诱导的各实验组hMSCs均出现不同程度的增殖,诱导7d后hMSCs的形态即发生明显改变,细胞紧密生长,体积明显增大,纺锤形细胞比例下降,多为卵圆形或柱状细胞,相邻细胞间有接触。2周后细胞之间连接愈加紧密。3～4周后,细胞增殖速度减慢,相邻细胞间逐渐相连呈肌管状,细胞核/胞浆比例明显降低,胞浆内有细小的颗粒样结构,且颗粒样结构多聚集于细胞核周围。阴性对照组hMSCs无任何明显改变。 2.实验4周后,用免疫组化法鉴定cTnI、Cx43:在阴性对照组上述两蛋白均呈阴性表达,而在经HGF作用后的5个实验组中均有一定的阳性表达。其中,cTnI阳性细胞百分率(%):3μg/L组为(14.24±0.46%)、5μg/L组为(25.32±1.41%)、10μg/L组为(38.46±1.41%)、20μg/L组为(27.38±1.32%)、40μg/L组为(20.36±2.15%),统计学分析各组之间差异具有统计学意义(P＜0.05),且以10μg/L组最高。结论 1.hMSCs经HGF诱导后的细胞间有肌管样结构形成,且存在cTnI、Cx43的阳性表达,出现可鉴定为心肌细胞的特异性免疫组化表现,提示HGF在体外能够诱导hMSCs向心肌细胞转化。 2.不同浓度HGF诱导的hMSCs转化心肌细胞百分率不同,而10μg/L HGF诱导组相对转化率最高,提示HGF的浓度对其诱导效果有影响,且其最佳诱导浓度可能为10μg/L。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【共引文献】